結核分枝桿菌WecA膜蛋白的表達和功能分析.pdf

1、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是結核病的病原體,全世界大約有1/3人口感染或攜帶這種桿菌。從上世紀末開始,由于耐多藥甚至廣泛耐藥結核分枝桿菌的出現(xiàn)使已經得到控制的結核病發(fā)病率又呈現(xiàn)逐年上升趨勢。因此,尋找新的抗結核藥物的靶點是當前結核病研究的主要任務之一。
　　 結核分枝桿菌細胞壁具有獨特的結構,對于維持細胞的生存和繁殖有非常重要的作用。其細胞壁的核心結構由三種大分子組成,由外至內分別為分枝

2、菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖。其中聚阿拉伯半乳糖與肽聚糖之間是通過L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺(L-rhanmose-D-N-GlcNAc)銜接雙糖共價連接起來的,這個銜接雙糖對于維持結核分枝桿菌細胞壁的完整性有極其重要的作用。
　　 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖合成的第一步反應是將糖基供體UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1-P)基團轉移到脂類載體C50-P(D

3、ecaprenyl phosphaye)上形成C50-P-P-GlcNAc,此反應由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶催化完成。N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶對于銜接雙糖的合成有至關重要的作用,一旦該酶被抑制或缺失,銜接雙糖將不能合成。
　　 在大腸桿菌中wecA基因編碼的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶(WecA)參與脂多糖(LPS)中O-抗原多糖的合成。本實驗室通過對大腸桿菌wecA基因敲除菌株MV501中LPS合成的補償實驗,證

4、實了結核分枝桿菌Rv1302基因是WecA的編碼基因wecA;并構建了恥垢分枝桿菌wecA基因敲除菌株,通過測定其生長曲線和使用電鏡觀察其形態(tài)學和細胞結構變化,證明了wecA是分枝桿菌生長必需基因。由此可見,WecA是研發(fā)抗結核藥物的一個非常好的潛在靶點。
　　 通過對結核分枝桿菌WecA的結構預測,WecA是一個具有11個跨膜結構域的膜蛋白。由于其結構的復雜性,難于在E.coli宿主細胞中獲得高表達的WecA膜蛋白,也不便對W

5、ecA膜蛋白進行純化。
　　 目的:
　　 1.用pET16b-Tb wecA表達載體在E.coli ER2566菌株中表達WecA膜蛋白并進行純化;2.建立WecA酶活性分析方法,分別使用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)技術對WecA酶活性進行鑒定;3.嘗試WecA膜蛋白表達的其它方法,包括構建pCold-Tb wecA表達載體,在E.coli MV501菌株中低溫誘導WecA膜蛋白的表達;獲取刪除5'端的

6、wecA基因,構建pET29b-Tb wecAdel1和pET29b-Tb wecA del2表達載體,在多種大腸桿菌表達菌株中表達N末端截短的WecA膜蛋白;使用MembraneMax Protein Expression Kit在體外表達WecA膜蛋白。
　　 結果:
　　 1.用pET16b-Tb wecA表達載體在E.coli ER2566菌株中表達WecA膜蛋白并純化出WecA膜蛋白
　　 在25℃條件

7、下用終濃度1 mM的IPTG誘導pET16b-Tb wecA/ER2566生長16 h。用超聲方法破碎誘導后的細菌,提取細胞膜組分,用去污劑n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltoside,DDM)溶解膜蛋白,將樣品分別進行Dot blot,SDS-PAGE和Western blot分析。從pET16b-Tb wecA/ER2566的膜組分中能夠檢測到表達的WecA蛋白。
　　 用鎳-組氨酸親和層析

8、法對帶有N-末端組氨酸標簽的WecA融合蛋白進行純化,對純化的WecA蛋白進行酶活性分析。
　　 2.建立了WecA酶活性分析方法
　　 (1)WecA酶活性檢測:TLC法
　　 將底物C50-P和UDP-GlcNAc與純化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水抽提有機相并真空干燥。用氯仿溶解樣品后,將樣品點在TLC板上進行層析,用磷鉬酸對脂類進行顯色,通過底物C50-P的消耗量和產物C50-P-P-GlcN

9、Ac的生成量來確定WecA酶活性。結果顯示,用TLC法檢測到了純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶活性。
　　 (2)WecA酶活性檢測:HPLC法
　　 將反應底物C50-P和UDP-GlcNAc和純化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水萃取反應液,對水相進行HPLC檢測,通過底物UDP-GlcNAc的減少量來確定WecA酶活性。結果顯示,純化的WecA蛋白與底物共同孵育后,底物UDP-GlcNA

10、c有了明顯的消耗,峰面積減小了約20％,由此進一步證明了所純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶活性。
　　 3.嘗試了WecA膜蛋白表達的其它方法
　　 (1)以pCold-Tb wecA為表達載體,低溫誘導WecA膜蛋白在E.coliMV501菌株中的表達
　　 用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pET16b-Tb wecA質粒,將Tb wecA基因克隆到pColdⅡ載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點,構

11、建出pCold-Tb wecA表達質粒。所構建的pCold-Tb wecA載體具有冷休克基因cspA啟動子,便于在低溫誘導表達蛋白,提高蛋白的可溶性和穩(wěn)定性。此外該載體還具有N-末端組氨酸標簽序列,表達WecA融合蛋白,便于蛋白的檢測和純化。
　　 在15℃條件下用終濃度1 mM的IPTG誘導WecA蛋白的表達。將上清組分、沉淀組分和膜蛋白進行SDS-PAGE及Western blot分析。結果表明,從pCold-Tb wecA

12、/MV501的膜蛋白組分中能夠檢測到表達的WecA蛋白。
　　 (2)N端截短的WecA膜蛋白在大腸桿菌中的表達
　　 根據(jù)wecA全基因序列設計特異性引物,用PCR方法獲得刪除N末端1個跨膜區(qū)的基因Tb wecA del1及刪除N末端3個跨膜區(qū)的基因Tb wecA del2,構建pMD18-Tb wecA dell和pMD18-Tb wecA del2克隆載體,并對陽性重組質粒進行核苷酸序列測定。
　　 用Nd

13、eⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD18-Tb wecA del1和pMD18-Tb wecA del2克隆質粒,分別將Tb wecA del1和Tb wecA del2基因片段連接到pET29b載體,構建pET29b-Tb wecA dell和pET29b-Tb wecA del2表達質粒。截短的WecA蛋白(WecA dell和WecA del2)的C-末端與組氨酸標簽融合,便于截短蛋白的檢測和純化。
　　 分別將pET29b-Tb

14、wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表達載體轉化至E.coliBL21(DE3)、CD41(DE3)和ER2566菌株中,在37℃條件下用終濃度為1 mM的IPTG誘導WecA截短蛋白的表達。將上清、沉淀組分和膜蛋白進行SDS-PAGE和Western blot分析,在各組分中沒有檢測到WecA截短蛋白的表達,說明N末端的氨基酸序列可能對維持WecA蛋白的結構十分重要。
　　 (3)WecA膜蛋白的體外表達

15、
　　 分別將pET16b-wecA,pET29b-wecA dell及pET29b-wecA del2質粒作為模板加入到體外表達系統(tǒng)(MembraneMax Protein Expression Kit)中,經過30 min的起始反應和2 h的補充反應后,將反應產物進行SDS-PAGE和Western blot分析以及WecA酶活性鑒定,但尚未獲得足夠量有活性的WecA全長或截短膜蛋白。對WecA膜蛋白的體外表達條件需進一步優(yōu)

16、化。
　　 結論:
　　 1.以pET16b-Tb wecA質粒為表達載體,在E.coli ER2566細胞中表達了WecA膜蛋白,并對WecA蛋白進行了純化。
　　 2.建立了WecA酶活性分析方法,分別利用TLC和HPLC檢測到了純化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶活性,從酶學角度進一步證實了結核分枝桿菌Rv1302基因就是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶(WecA)的編碼基因wecA,同時也為

17、進一步研究該酶的催化特性奠定了基礎。
　　 3.嘗試了表達WecA膜蛋白的其它方法:用pCold-Tb wecA表達載體在E.Coli MV501菌株中表達了WecA膜蛋白,但表達量沒有提高;構建了pET29b-TbwecA del1和pET29b-Tb wecA del2兩個表達載體,并分別使用三種E.coli表達菌株嘗試表達WecA截短蛋白,但尚未獲得WecA截短蛋白,說明N末端氨基酸序列對WecA蛋白有重要作用;初步嘗試了