豬鏈球菌2型與豬中性粒細胞相互作用研究.pdf

1、豬鏈球菌2型(Strreptococcus suis serotype2，SS2)是一種人畜共患傳染病病原，對于養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及人類的生命健康具有嚴重威脅。近年來，豬鏈球菌2型的危害引起國內外的廣泛關注，其分子致病機理和免疫方面的研究是目前研究的熱點。盡管很多學者從單個或多個毒力因子的角度去闡述豬鏈球菌2型的分子致病機理，取得了一些進展，但仍無法很好的解釋其如何突破機體的天然免疫系統以及血腦屏障，從而引起腦膜炎等病癥。
　　

2、 病原菌致病通常不是由單一毒力因子引起，而是由多種毒力因子的共同作用而造成的，毒力因子在調控系統的控制下，形成一個精致的調控網絡。雙組份調控系統(Two-Component Regulatory System，TCS)是細菌中廣泛存在的一種重要的信號轉導機制，能將外界環(huán)境中感應到的信息傳給內部系統。研究證實，TCS參與調控細菌毒力因子表達、細菌致病性和生長代謝等，目前在SS2中發(fā)現有至少15對雙組分調控系統。中性粒細胞(Polymorp

3、honuclear leukocytes，PMNs or Neutrophils)存在血液中，是體內數量最多的白細胞，類似巨噬細胞，具有吞菌活性，在急性炎癥中起著十分重要的作用，是機體抵抗病原菌的第一道防線。
　　 病原與宿主的相互作用在其致病過程中扮演重要作用。盡管多種SS2毒力因子已被證實在致病中具有重要作用，但細菌與天然免疫系統作用后基因表達變化的全面分析報道卻很少。而且，對豬鏈球菌2型引起急性炎癥或逃避宿主天然免疫的分子

4、機制了解非常有限。本文選取SS2野生株SC19和豬中性粒細胞(PMNs)為研究對象，將SS2與PMNs相互作用后，通過基因表達譜芯片、生物信息學分析、熒光定量PCR等方法獲得差異表達基因并分類；以CD1小鼠為模型評價雙組份調控系統基因1660HK/RR，1910HK/RR和1094HK/RR基因缺失突變株△1660HK/RR，△1910HK/RR、△1094HK/RR的毒力以及引起的炎癥反應，為闡明雙組份調控系統引起急性炎癥反應或免疫逃

5、避的分子機制，深入研究S.suis2分子致病機理奠定理論基礎，也為S.suis2新型疫苗和藥物靶標分子設計提供新的思路。具體研究內容如下：
　　 1.豬中性粒細胞的分離和培養(yǎng)
　　 本研究采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PMNs，經Giemsa染色后檢測PMNs的純度為98%，采用苔盼藍(0.01%濃度)排除法檢測PMNs活力為96%，符合實驗要求。
　　 2.豬鏈球菌2型感染豬中性粒細胞后轉錄

6、表達譜結果與分析
　　 將SS2與PMNs互作，并在0.5h、1h、和3h時間點采集樣品制備表達譜芯片，與無中性粒細胞對照組的雜交后的表達譜芯片的信號值相比較，Fold Change(FC)≥2的轉錄本為上調，FC≤0.5的為下調，FC在0.5到2之間為無顯著變化。結果表明，0.5h時有154個基因上調表達，188個基因下調表達；1h時有213個基因上調表達，223個基因下調表達；3h時有531個基因上調表達，665個基因下調表

7、達。3個時間點都上調的基因有75個，都下調的基因有81個。
　　 進一步對差異表達的TCS基因分析發(fā)現，SSU05_0427、SSU05_0906、SSU05_0944、SSU05_1358、SSU05_1595、SSU05_1660和SSU05_1685等7個基因一直上調表達；而SSU05_0883、SSU05_2090，2個基因一直下調表達；SSU05_0430、SSU05_1910和SSU05_2148，3個基因先下調表達

8、后上調表達；SSU05_1094基因先上調表達，然后下調表達。
　　 3.TCS基因缺失突變株對致病性和炎癥反應的影響
　　 在SS2與天然免疫細胞豬中性粒細胞的相互作用過程中，雙組份調控系統基因呈現不同的表達情況，且在不同時間發(fā)揮作用。1094HK/RR、1660HK/RR和1910HK/RR基因分別在免疫反應的早期、中期和后期發(fā)揮作用。
　　 以CD-1小鼠為模型，動物實驗結果表明，雙組份調控系統基因1910