骨關節(jié)炎軟骨下骨重建中成骨細胞增殖與凋亡的機制.pdf

1、研究背景:骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見的關節(jié)疾病,以關節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質增生為特征的慢性關節(jié)病。最近研究表明軟骨下骨的病變在骨關節(jié)炎的發(fā)病過程中起主要作用。軟骨下骨病變主要包括硬化、骨贅形成和骨小梁稀疏變窄,其中骨硬化和骨贅形成主要由成骨細胞完成,而骨小梁數(shù)目變少、間隙增寬主要由破骨細胞完成。OA軟骨下骨病變焦點是成骨細胞增殖和凋亡異常,且較正常成骨細胞分泌大量細胞因子和活性物質。因此闡明成骨細胞增殖與

2、凋亡的調控機制,對闡明軟骨下骨的病變機制,對提出新的OA.治療措施有極大幫助。
　　 成人的骨轉化和骨重建過程中成骨細胞主要作用是合成骨質,在完成轉化或重建后,可分化為骨襯細胞、骨細胞或發(fā)生凋亡從體內消失。軟骨下骨中新生成骨細胞由骨髓間充質遷移而來,與凋亡消失的細胞成一定數(shù)量比例。成骨細胞增殖和凋亡是維持成骨細胞數(shù)目的和功能穩(wěn)定關鍵環(huán)節(jié)。而成骨細胞的增殖和凋亡受基因的嚴格調控,并受體內多種因素的調節(jié)。但目前對成骨細胞在軟骨下骨中

3、遷移、增殖、分化和凋亡過程中存在的調控機制尚不清楚。
　　 OA過程中軟骨細胞發(fā)生大量凋亡已被證實,細胞凋亡過程受多種凋亡基因嚴密調控。細胞凋亡發(fā)生時細胞產生大量細胞凋亡因子,但受制于凋亡檢測技術,過去研究每次只能針對幾個因子進行研究,但調控網絡涉及眾多因子,因此到目前詳細的凋亡調控機制仍不清楚。OA中成骨細胞不斷發(fā)生凋亡,并在軟骨下骨硬化病變中起到重要作用。但由于成骨細胞處于骨組織內對其凋亡的檢測受到極大的限制。如何高效、準確

4、地檢測軟骨和軟骨下骨中的細胞凋亡是目前OA研究中亟待解決的問題。近年,蛋白質組學飛速發(fā)展,檢測蛋白質的技術越來越先進。上世紀出現(xiàn)的蛋白芯片技術在蛋白質研究領域中展現(xiàn)出其強大功能?？贵w芯片是蛋白質芯片的一種,根據(jù)抗體抗原的特異性反應原理,可同時檢測多種蛋白質,且操作簡便,具有極高的靈敏性。目前已出現(xiàn)多種可直接完成對血液、尿液、細胞裂解液中細胞因子檢測的抗體芯片。當今先進的芯片技術為疾病相關分子的發(fā)現(xiàn)、疾病的分子診斷和治療藥物的開發(fā)提供高效

5、快捷的研究手段。目前還沒有出現(xiàn)針對OA研究的芯片,如何采用目前的抗體芯片技術來認識和解決OA中細胞凋亡問題,值得我們積極探索。
　　 前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)在體內外具有強大的骨代謝調節(jié)作用。PGE2可通過細胞表面的4種特異性受體作用于成骨細胞和破骨細胞,產生顯著的骨形成和骨吸收效果。OA患者的軟骨下骨中成骨細胞分泌PGE2量存在差異,可分為高低兩類,代表了兩種不同類型OA。在高OA病人,其成骨

6、細胞分泌大量PGE2,軟骨下骨較低OA組和正常軟骨下骨硬化程度高,提示OA軟骨下骨中PGE2的含量與成骨細胞的功能狀態(tài),增殖和凋亡的調控都有密切關系。但PGE2對成骨細胞增殖和凋亡的具體調控機制仍不清楚。p21又稱p21WAF1/CIP1是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,與細胞的增殖、分化和凋亡具有密切關系。p21在成骨細胞增殖與凋亡調控中具有重要作用,但PGE2對成骨細胞的p21作用如何目前未有報道。HSP27是熱休克蛋白sHSP亞家

7、族中的重要一員,保護細胞免受各種應激因素的損傷,并參與細胞的增殖、分化及細胞凋亡的信號轉導調節(jié),誘導型HSP27主要在細胞受到高溫、紫外線、藥物等刺激下大量表達,調節(jié)細胞凋亡的關鍵信號通路。
　　 目的:采用可同時檢測43種凋亡相關蛋白的人類細胞凋亡因子抗體芯片對人OA關節(jié)軟骨和軟骨下骨組織進行分析。探討OA軟骨和軟骨下骨中細胞凋亡因子的變化,以進一步了解細胞凋亡與OA發(fā)生、發(fā)展的關系。研究PGE2對成骨細胞增殖和凋亡的調控作用

8、與p21的關系,為闡明OA軟骨下骨病變提供實驗依據(jù)。
　　 方法
　　 1.采用RayBio(R)公司研發(fā)的人類細胞凋亡因子抗體芯片檢測技術。關節(jié)軟骨和軟骨下骨組織取自全關節(jié)置換OA病人的膝關節(jié),正常對照關節(jié)取自外傷截肢患者。液氮研磨提取關節(jié)軟骨、軟骨下骨總蛋白,芯片檢測嚴格按操作說明進行,室溫下封閉30min,加樣品蛋白稀釋液置4°恒溫搖床孵育過夜,次日加一抗室溫孵育2h,漂洗3次,加HRP-二抗室溫孵育1.5h,漂洗

9、3次,化學發(fā)光法檢測,激光掃描儀掃描x膠片,圖像由RayBio(R)圖像軟件分析,數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本f檢驗,P值<0.05,為差別有統(tǒng)計學意義。
　　 2.10umol/L PGE2處理MC3T3-E1成骨細胞30min,2h,4h。對照組不處理。提取各組細胞RNA,通過Real-time PCR檢測各組細胞p21、HSP27 mRNA的變化。提取各組細胞總蛋白,western blot檢測p21、HSP27蛋白表達的變化

10、。
　　 結果
　　 1.采用人凋亡因子抗體芯片對OA軟骨和軟骨下骨進行分析并與正常關節(jié)的做比較發(fā)現(xiàn),正常軟骨和OA軟骨的芯片膜檢測位點全部表達,陽性對照位點明顯,陰性對照位點未有信號。OA軟骨中共有38種凋亡因子較正常組表達顯著增高(P值均<0.05),包括bad、bax、bcl-2、p53、caspase-3等。OA軟骨中BID表達顯著下調(P=0.002)。CD40、FasL等4種因子表達變化不顯著(P值均>0.0

11、5)。軟骨下骨的檢測發(fā)現(xiàn)所有芯片上的位點都有顯影,OA組與正常組比較只有9種凋亡因子顯著變化(P值均<0.05),其余因子變化不顯著(P值均>005)。
　　 2.采用10umol/L,PGE2處理MC3T3-E1成骨細胞30min,2h,4h后。采用Real-time PCR法檢測p21和HSP27 mRNA,western blot檢測p21和HSP27蛋白發(fā)現(xiàn),p21 mRNA和蛋白量隨時間增加表達增高,在2h時達高峰。H