銅綠假單胞菌群體感應抑制劑的分離與活性評價.pdf

1、目前，細菌耐藥問題日益嚴重，使傳統(tǒng)抗生素面臨著失效的危險，直接威脅到人類的生命健康。因此，尋找新的靶點來開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。群體感應(Quorum sensing，QS)是指細菌通過感知菌群中信號分子的濃度變化，從而對周圍環(huán)境做出自身調整以抵抗不利因素的行為。QS系統(tǒng)調控著致病菌的多種行為如生物被膜的形成及毒力因子的表達。銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一種常見的機會致病菌，它的耐藥性及毒力使得治療

2、銅綠假單胞菌感染十分困難。P.aeruginosa的群體感應(QS)系統(tǒng)對其致病力及毒力的產生（如綠膿菌素、鼠李糖脂、彈性蛋白酶、swarming運動、生物被膜的形成等）具有重要調控作用。因此，干擾P.aeruginosa QS系統(tǒng)是削弱其毒力的一個發(fā)展策略。群體應抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs）能夠降低P.aeruginosa毒力及致病力，同時不抑制細菌的生長，與傳統(tǒng)抗生素相比不會對細菌的生存產生

3、選擇性壓力，理論上不易產生細菌耐藥性，為新型抗感染藥物的研究提供了一條新的途徑。
　　本實驗室在前期工作中發(fā)現(xiàn)海洋真菌Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產物及中藥厚樸的粗提物具有銅綠假單胞菌群體感應抑制活性。本文目的是從Aspergillussp.SY012的發(fā)酵產物及厚樸的粗提物中追蹤分離群體感應抑制劑，并對其活性進行評價。
　　利用P.aeruginosa（QSIS-lasI）及P.aeruginosa（PQ

4、SI-pqsA）報告菌株追蹤檢測Aspergillus sp.SY012發(fā)酵粗提物的活性，采用硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、HPLC對活性成分進行分離純化，最終得到兩個活性化合物，利用核磁共振波譜解析確定化合物結構分別為α-環(huán)匹阿尼酸及其同分異構體異α-環(huán)匹阿尼酸。數(shù)據(jù)分析表明，在亞抑菌濃度下，它們對P.aeruginosa PAOI的彈性蛋白酶活性、綠膿菌素及鼠李糖脂產量、swarming運動等毒力因子都具有顯著抑

5、制作用，并且可顯著降低las、rhl及pqs系統(tǒng)相關基因轉錄水平的表達。利用大腸桿菌異源報告菌株E.coli MG4/pKDT17和E.coli pEAL08-2檢測異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對las和pqs群體感應系統(tǒng)的作用，異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對于異源表達的las及pqs系統(tǒng)均有顯著抑制作用，其中相同濃度的異α-環(huán)匹阿尼酸活性強于α-環(huán)匹阿尼酸。二者具有相同的平面結構，唯一不同就是5位C的立體結構，可能對化合物的Q

6、SI活性起到重要作用。
　　利用了P.aeruginosa（QSIS-lasI）報告菌株對中藥厚樸的粗提物進行活性追蹤及檢測，得到明顯的活性位點，采用生物自顯影薄層色譜、制備薄層色譜和高效液相色譜技術分離到活性化合物，通過核磁共振波譜解析確定活性化合物為和厚樸酚。在亞抑菌濃度下，和厚樸酚能夠抑制P.aeruginosa PAOI毒力因子的產生，包括swarming運動、綠膿菌素及鼠李糖脂產量，RT-PCR檢測結果表明和厚樸酚對P.

7、aeruginosa PAOI QS相關調控基因的mRNA表達水平有顯著抑制作用。和厚樸酚(honokiol)是具有抗氧化，抗炎，抗焦慮，抗抑郁等多種生物活性的多酚，為厚樸的主要成分。和厚樸酚作為P.aeruginosa QSI，是它生物活性的又一新發(fā)現(xiàn)。
　　本文從Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產物及中藥厚樸的粗提物中分離得到了銅綠假單胞菌群體感應抑制劑，并首次發(fā)現(xiàn)α-環(huán)匹阿尼酸、異α-環(huán)匹阿尼酸及和厚樸酚具有Q