miR--503和miR--135a靶向Zfp217在成脂分化上的作用機制研究.pdf

1、脂肪細胞主要是由起源于中胚層的多能間充質干細胞逐漸分化或發(fā)育而來。由間充質干細胞發(fā)育為成熟脂肪細胞包含定型和分化兩個過程，這兩個過程受到高度協(xié)調而且復雜的網(wǎng)絡調控。動物從胚胎發(fā)育持續(xù)到成年都存在脂肪形成的過程。近年來，研究報道鋅指蛋白基因參與成脂分化的關鍵轉錄調節(jié)，不僅能夠調節(jié)細胞的成脂定型，也能調節(jié)細胞的成脂分化和脂肪沉積。值得注意的是，與脂質代謝相關的鋅指蛋白基因受miRNA調控，進而影響脂肪細胞分化的研究逐漸被報道。本課題組在前期

2、的研究中，將豬原代脂肪來源的血管基質細胞體外誘導成脂分化，利用轉錄組測序及實時定量PCR技術篩選出1個保守的脂肪SV細胞成脂分化的差異表達基因Zfp217，通過RNAi技術初步確定了其在豬源脂肪SV細胞成脂分化過程中的作用。但其在細胞成脂定型和分化上的功能以及如何受miRNA調控而影響脂肪細胞的分化作用尚不清楚。主要研究結果如下:
　　1.鋅指蛋白Zfp217的生物信息學分析
　　運用生物信息學技術分析了Zfp217的多級結

3、構和序列特征，結果顯示:在三個物種(hsa、mmu和ssc)中，Zfp217均含有8個鋅指結構，且第6個和第7個鋅指結構在三個物種中的序列相似性最高;利用同源建模方法構建了構象符合立體化學規(guī)則的Zfp217蛋白序列三維結構模型;Zfp217蛋白質理化性質分析表明其在三個物種中均為親水性蛋白，熱穩(wěn)定性低且其氨基酸序列不穩(wěn)定;分析Zfp217的跨膜結構域發(fā)現(xiàn)，只在鼠和豬中預測到跨膜結構域;轉錄后修飾顯示:在人、鼠和豬中都預測到了O-GalN

4、Ac蛋白質糖基化位點和磷酸化位點。
　　利用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索Zfp217在真核生物多個物種中的蛋白序列，構建同源進化樹，分析各物種蛋白序列的鋅指結構基序。結果顯示:從系統(tǒng)進化樹來看，哺乳動物綱是其中最大的一類，各個綱或目之間界限分明，相同的綱或目內物種的序列具有更好的同源性且高度保守。C2H2類鋅指結構基序廣泛地分布在各個物種的序列中，并且數(shù)目從5到8個不等，數(shù)目為8的物種占絕大多數(shù)。
　　利用GEO數(shù)據(jù)庫檢索Zfp217

5、功能獲得或功能缺失條件下的芯片數(shù)據(jù)集，對檢索的數(shù)據(jù)集利用R語言分析獲得了4個基因與fp217表達水平的變化相一致，33個基因相反。對這些獲得的差異表達基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們富集在具有較高的生物活性過程中，并且富集在腫瘤癌癥相關的生物學過程上。利用GEO數(shù)據(jù)挖掘獲得121個乳腺癌差異表達miRNA，其中19個預測到在人和鼠Zfp217的3'UTR存在結合位點。在嚴格的篩選條件下，共預測到164個保守的miRNA靶向作用Zfp217

6、，進一步文獻挖掘發(fā)現(xiàn)，其中102個miRNA與癌癥相關，關聯(lián)性最大的癌癥是乳腺癌。此外，數(shù)據(jù)挖掘還顯示Zfp217與肥胖和成脂分化標記基因高度相關。因此，推測Zfp217可能參與成脂分化過程，并受miRNA的調控。
　　2.Zfp217的表達與功能研究
　　利用QPCR或Western blot分析了Zfp217在C3H10T1/2細胞成脂分化過程、豬和鼠不同組織以及肥胖小鼠模型脂肪組織中的表達模式。結果顯示:Zfp217在

7、C3H10T1/2細胞成脂分化過程中的上調表達與成脂分化核心轉錄因子基因Pparg2相一致。在內臟脂肪組織中，Zfp217與Pparg2的表達趨勢相一致，并呈現(xiàn)出相似的顯著性。Zfp217的表達與一些促進成脂分化的早期標志基因（Cebpb，KLF4，Ebf1和ZNF395）的表達模式相一致。
　　克隆了鼠Zfp217基因編碼區(qū)，探討了在Zfp217功能獲得或功能缺失情況下對細胞成脂分化的影響，結果顯示:Zfp217功能獲得或缺失與

8、C3H10T1/2細胞成脂分化的脂滴形成以及甘油三酯含量呈正相關。利用QPCR、流式細胞術、哺乳動物雙雜交等試驗分析了Zfp217調控細胞成脂分化的機制，結果顯示:Zfp217超表達能夠顯著抑制Wnt信號基因的mRNA水平。此外，細胞成脂誘導4d時，成脂標記基因在Zfp217的不同處理組發(fā)生顯著性改變。雙雜交試驗顯示在鼠源背景下，Zfp217與Ezh2存在蛋白互作。表明Zfp217促進細胞成脂分化是通過抑制細胞DNA合成，影響細胞周期，

9、并與Ezh2互作抑制Wnt信號基因的表達而實現(xiàn)的。
　　3.靶向作用Zfp217的miRNA篩選、驗證及功能研究
　　利用多種生物信息學預測網(wǎng)站預測靶向作用fp217的miRNA:在人中共預測到176個，在鼠中共預測到213個，在人和鼠中共同出現(xiàn)的miRNA有42個。利用功能注釋和進化分析進一步篩選出了5個候選miRNA:miR-503、miR-135a、miR-26a、miR-19a/b和miR-1a。利用雙熒光素酶試驗、

10、QPCR和Western blot驗證了miR-503、miR-135a和miR-19a可以通過靶向結合Zfp2173'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)降低Zfp217在細胞內的表達。
　　分析了候選miRNA在C3H10T1/2細胞成脂分化過程中、豬和鼠不同組織中以及肥胖小鼠模型五種脂肪組織中的表達模式。利用多種實驗技術檢測了miR-503和miR-135a對細胞增殖、細胞周期和細胞DNA合成的