化合物P7C3--A20在非酒精性脂肪肝中的治療作用及機(jī)制.pdf

1、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷。包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化1。在美國(guó)罹患NAFLD的人群已達(dá)到人口總數(shù)的30％2，國(guó)內(nèi)流行病學(xué)的研究表明，NAFLD已成為我國(guó)引起肝功能異常以及慢性肝病的

2、第二大元兇3。
　　煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又稱(chēng)為輔酶Ⅰ，是電子傳遞鏈中的ComplexⅠ的重要遞氫物。NAD的合成包括從頭合成途徑(De novo pathway)和補(bǔ)救(Salvage pathway)合成途徑兩條途徑，其中補(bǔ)救合成途徑是維持NAD體內(nèi)水平的主要途徑。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是補(bǔ)救合成途徑中的合成限速酶，維持體內(nèi)NAD

3、的水平4。NAD是生成ATP的必須物質(zhì)，同時(shí)ATP還廣泛參與機(jī)體發(fā)育、血管生成、細(xì)胞凋亡、組織炎癥、神經(jīng)退行性病變和腫瘤發(fā)生等病理生理過(guò)程5-7。
　　在我們課題組之前關(guān)于NAMPT功能方面的研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT和NAFLD之間存在重要關(guān)聯(lián)。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝臟中，會(huì)隨著年齡增大而表達(dá)量逐漸減低，而且NAMPT表達(dá)量的降低是老年鼠NAFLD發(fā)病和進(jìn)展的重要促因8。但NAMPT的相關(guān)激活劑能否對(duì)NAFLD起到治療

4、作用，以及其治療作用的機(jī)制都尚不明確。
　　由于NAMPT是一個(gè)酶，因此我們期望能直接找到可以干預(yù)其作用的化合物。我們把目光瞄準(zhǔn)了P7C3-A20這一化合物。P7C3-A20的CAS號(hào)1235481-90-9，屬于氯丙基咔唑類(lèi)化合物，是latrepirdine（一種神經(jīng)元保護(hù)劑）的同源化合物。前期有報(bào)道發(fā)現(xiàn)該化合物可作為“潛在的NAMPT激動(dòng)劑”升高腦內(nèi)的NAD水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。我們猜測(cè)，P7C3-A20很有可能也能在肝臟內(nèi)

5、發(fā)揮作用，擬分三步對(duì)化合物P7C3-A20對(duì)NAFLD的治療作用和機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成四組，每組不少于6只，分別為Chow組，Chow+A20組，HFD組和HFD+A20組。Chow組以普通飼料喂養(yǎng)，HFD組以高脂飼料喂養(yǎng)。HFD+A20組在HFD誘導(dǎo)16W后體外腹腔給藥，給藥量20mg/kg/d。給藥2W后，先從體重、代謝率上對(duì)小鼠整體代謝水平對(duì)NAFLD造模進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后驗(yàn)證經(jīng)過(guò)P7C

6、3-A20治療后的小鼠肝臟中是否存在NAD含量水平的改變。
　　2.第二步檢測(cè)P7C3-A20對(duì)NAFLD各項(xiàng)病理指標(biāo)及并發(fā)癥進(jìn)程相關(guān)指標(biāo)的影響。首先檢測(cè)血清中的血脂、肝功酶系等指標(biāo)各組之間的差異，然后再在肝臟組織中檢測(cè)氧化應(yīng)激、炎癥因子、肝臟纖維化標(biāo)志物、細(xì)胞凋亡標(biāo)志物、胰島素敏感度等指標(biāo)，檢測(cè)P7C3-A20對(duì)NAFLD病程進(jìn)展和并發(fā)癥的治療作用。另外，我們還檢測(cè)了另一NAD補(bǔ)充藥物nicotinamide riboside(

7、NR)與SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)NAFLD的治療作用。
　　3.第三步探討P7C3-A20對(duì)NAFLD治療作用的機(jī)制進(jìn)行研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的濃度，推測(cè)P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的關(guān)系。所以對(duì)AMPK/CREB在肝細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)磷酸化的標(biāo)志物phospho-CREB和phospho-AMPK。將AMPKα2+/-小鼠進(jìn)行雜交配種，制備AMPK

8、α2-/-小鼠。將WT小鼠設(shè)置為對(duì)照組，AMPKα2-/-小鼠設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組。兩組小鼠均給予腹腔注射P7C3-A20，3天，20mg/kg/d。取血清檢測(cè)血清中FGF1和FGF21的變化，取肝臟檢測(cè)AMPK通路相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.首先HFD組相較于Chow組，可以明確HFD誘導(dǎo)NAFLD模型成功。然后對(duì)NAFLD模型小鼠按照Chow組，Chow+A20組，HFD組和HFD+A20組四組分組進(jìn)行NAD

9、、NADH以及NAD/NADH的檢測(cè)，首先驗(yàn)證P7C3-A20給藥后確實(shí)提升對(duì)NAD在肝臟中的表達(dá)水平。
　　2.HFD組給予P7C3-A20后，相比較于HFD對(duì)照組，小鼠減重明顯，代謝率也有所提升;血清中肝功酶系指標(biāo)有所改善;小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞炎癥水平以及細(xì)胞凋亡水平均有所下降;肝臟的纖維化及纖維成分均有所好轉(zhuǎn)，說(shuō)明P7C3-A20對(duì)NAFLD確實(shí)有治療作用。NR、SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)NAFLD也都有治療作用，

10、但是NR比SIRT1過(guò)表達(dá)作用更為明顯。
　　3.在NAFLD模型小鼠上給予化合物P7C3-A20，可上調(diào)血清中兩種重要代謝調(diào)控因子FGF1和FGF21的表達(dá)。同時(shí)P7C3-A20給藥可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表達(dá)。同時(shí)，此外，P7C3-A20還明顯增加血FGF1和FGF21的濃度。肝臟以及血清中FGF1和FGF21表達(dá)明顯提高，相對(duì)于對(duì)照組野生型小鼠，P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上對(duì)A