Clostridium aceticum的代謝調(diào)控與利用CO2產(chǎn)乙醇的研究.pdf

1、生物乙醇是一種可再生的清潔能源，目前主要由植物原料生產(chǎn)，正逐漸成為汽油的替代燃料。Clostridium aceticum（C.aceticum）是一種嚴(yán)格厭氧的乙酸產(chǎn)生菌，它既能以H2+CO2為能源和碳源自養(yǎng)生長(zhǎng)，又能以果糖、丙酮酸、延胡索酸為碳源異養(yǎng)生長(zhǎng)。C.aceticum可通過(guò)Wood-Ljungdahl途徑將H2+CO2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并進(jìn)一步代謝產(chǎn)生乙酸。乙醛鐵氧還原蛋白酶（Aldehyde Ferredoxin Oxid

2、oreductase，AOR）嚴(yán)格無(wú)氧條件下能將乙酸還原為乙醛，乙醛可進(jìn)一步還原為乙醇。對(duì)AOR酶的研究表明，來(lái)自于菌株P(guān)yrococcus furiosus和Thermococcus sp.ES-1的AOR酶具有乙酸還原活性。
　　本論文通過(guò)將AOR酶基因過(guò)表達(dá)，對(duì)野生型C.aceticum進(jìn)行代謝改造，以重組質(zhì)粒的形式將乙酸還原酶AOR的編碼基因轉(zhuǎn)到野生型菌株，使重組型C.aceticum能利用CO2產(chǎn)生乙醇。本論文的研究結(jié)果

3、為構(gòu)建利用CO2產(chǎn)生乙醇的工業(yè)微生物提供了新的途徑：
　?。?）C.aceticum AOR酶的生物信息學(xué)分析：先從C.aceticum的基因組中的查找到4個(gè)AOR酶編碼基因，進(jìn)行多重序列比對(duì)后構(gòu)建基于AOR酶氨基酸序列的分子進(jìn)化樹(shù)，以進(jìn)化關(guān)系為基礎(chǔ)選出編號(hào)為WP_44825795.1和WP_44824935.1的兩個(gè)AOR蛋白。對(duì)序列進(jìn)行足跡定位分析，最終得到注釋為dhV、AFOR_N和AFOR_C的結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白具有與

4、Thermococcus sp. EP1和P.furiosus AOR酶相似的功能。
　　（2）C.aceticum AOR酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，編號(hào)為WP_044825795.1的AOR酶和P.furiosus AOR酶更具相似性，造成AOR酶蛋白結(jié)構(gòu)差異的來(lái)源，主要為螺旋（H）其次為折疊結(jié)構(gòu)（E）。通過(guò)同源建模預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明模板蛋白和目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)不同區(qū)主要集中在保守區(qū)域的端點(diǎn)處，保守區(qū)域內(nèi)部的結(jié)構(gòu)高度

5、一致。
　?。?）AOR酶編碼基因上下游序列分析：可視化基因組序列，結(jié)果顯示AOR編碼基因閱讀框的方向與上下游基因相反，表明aor基因有一個(gè)單獨(dú)的啟動(dòng)子。尋找并分析AOR酶編碼區(qū)上下游的序列，結(jié)果表明，在-10到-15位點(diǎn)的區(qū)間“AGGAGG”為AOR酶編碼基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，在-17到-26位點(diǎn)的區(qū)間為“TATTTTTTAAA”P(pán)ribnow框。
　?。?）C.aceticum過(guò)表達(dá)AOR酶基因的代謝預(yù)測(cè)：重構(gòu)C.ace

6、ticum全基因組酶蛋白的代謝反應(yīng)途徑，結(jié)果顯示C.aceticum全基因組酶主要作用在生物代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信號(hào)處理、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)系統(tǒng)和致病系統(tǒng)。對(duì)C.aceticum重組菌的代謝預(yù)測(cè)表明，由于AOR酶的過(guò)表達(dá)，重組菌中的乙酸最終被還原成乙醇，且推測(cè)過(guò)表達(dá)菌株還有可能會(huì)產(chǎn)生L-乳酸，甲酸和三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物。
　　（5）AOR酶基因過(guò)表達(dá)C.aceticum的構(gòu)建：根據(jù)前面的分析設(shè)計(jì)三對(duì)引物aor-prim，aor-

7、prim2和aor-prim3，以引物的最佳退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和驗(yàn)證，得到三個(gè)重組質(zhì)粒pMTL82151_thl_aor，pMTL82151_thl_aor2和pMTL82151_thl_aor3。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli CA434，在通過(guò)結(jié)合將質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)到C.aceticum中，經(jīng)篩選和驗(yàn)證，得到過(guò)表達(dá)aor，aor2和aor2的重組型C.aceticum。
　?。?）野生型和重組型C.aceti