荷花NnMYB4轉錄因子全長ORF克隆及功能分析.pdf

1、MYB轉錄因子普遍存在于高等植物中，在調控植物次生壁代謝過程中起重要作用。荷花（Nelumbo nucifera Gaern）是多年生水生植物，也是我國栽培面積最廣、品種資源最豐富的經(jīng)濟作物和觀賞植物之一。目前對荷花分子育種研究尚處于起步階段。本研究從荷花中分離克隆得到一個R2R3型MYB轉錄因子基因，并在擬南芥中對其功能進行驗證，旨在了解該基因在植物木質素合成中的作用，為進一步深入研究MYB轉錄因子調控植物次生壁發(fā)育的分子機理以及荷花

2、的遺傳育種改良奠定理論基礎。研究結果如下:
　　1.通過BLAST分析從荷花基因組里篩選與擬南芥AtMYB4序列同源性較高的荷花轉錄因子基因，根據(jù)其cDNA全長開放閱讀框（open reading frame，ORF）設計特異性引物，以荷花品種‘黑龍江紅蓮’幼葉為材料，通過RT-PCR擴增得到全長ORF，命名為NnMYB4。 NnMYB4基因ORF全長726 bp，編碼241個氨基酸，屬于R2R3-MYB轉錄因子G4亞組，與擬南芥

3、AtMYB4、菊花CmMYB1、玉米ZmMYB31進化關系較近。
　　2.組織定量結果表明，NnMYB4基因在荷花根、莖、葉柄、劍葉、幼葉、成熟葉中均有表達，且在幼葉中表達量相對較高，在劍葉中表達量最低。說明在不同器官組織中，NnMYB4的表達存在差異。
　　3.構建pGBKT7-NnMYB4酵母效應表達質粒，將其轉入酵母菌株Y2H，先后在單缺培養(yǎng)基SD/-Trp和雙缺培養(yǎng)基SD/-His-Ade上篩選培養(yǎng)，結果顯示，NnM

4、YB4無轉錄激活活性。
　　4.構建pMDC43-GFP-NnMYB4綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)融合表達載體，農(nóng)桿菌介導轉入洋蔥表皮細胞中，激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，NnMYB4蛋白定位于細胞核上。
　　5.構建pMDC43-NnMYB4過表達載體，采用農(nóng)桿菌介導法通過侵染擬南芥花序將其轉化擬南芥(Columbia-0，Col-0)，利用潮霉素抗性篩選和RT-PCR鑒定，獲

5、得NnMYB4過表達轉基因株系35S∷NnMYB4-1和35S∷NnMYB4-2。與野生型擬南芥wt相比，轉NnMYB4擬南芥植株花序莖變矮，花期延遲，莖木質部染色面積較小、染色程度變淺，木質素含量顯著降低，說明NnMYB4能抑制植株莖的生長和木質素的合成。過表達NnMYB4分析結果顯示，轉基因擬南芥At4CL1、AtC3H、 AtF5H、AtCOMT1、AtIRX8、AtCesA1、AtCesA7、AtCesA8等木質素、纖維素合成關