解脂耶氏酵母胞外脂肪酶性質研究.pdf

1、脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類重要的工業(yè)酶制劑，可以催化酯化、轉酯化、水解、醇解等多種反應，被廣泛用于生物燃料、食品加工、營養(yǎng)品、化妝品、醫(yī)藥等領域。本實驗室所培育的解脂耶氏酵母（Yarrowialiploytica）含有多個脂肪酶基因，其所生產(chǎn)的混合脂肪酶已成功應用于生物柴油、多元醇酯等產(chǎn)品的合成中。為細化對解脂耶氏酵母脂肪酶家族的了解，擴展其脂肪酶應用范圍，論文以解脂耶氏酵母胞外脂肪酶為研究重點，對Lip2、Lip

2、7、Lip8三個脂肪酶進行異源表達及酶學性質基礎理論研究，為后續(xù)解脂耶氏酵母脂肪酶家族應用奠定基礎。本論文主要進行如下工作:
　　(1)成功構建pPICZaA-lip2、pPICZaA-lip7、pPICZaA-lip8三個重組質粒，并在畢赤酵母GS115中成功實現(xiàn)Lip2、Lip7、Lip8的分泌表達。優(yōu)化了搖瓶階段發(fā)酵條件，在誘導溫度為25℃、誘導時間為72 h的發(fā)酵條件下，三個脂肪酶的水解酶活（對硝基苯酚棕櫚酸酯法）最佳，分

3、別是3.38 U/mL、0.18 U/mL、0.05 U/mL。
　　(2)本論文系統(tǒng)對比解脂耶氏酵母三個胞外脂肪酶催化能力，對畢赤酵母體系表達的脂肪酶進行相關酶學性質的研究。Lip2、Lip7、Lip8的5L發(fā)酵罐發(fā)酵液的水解酶活分別為4000 U/mL、4.12 U/mL、1.71 U/mL，Lip2的水解活性優(yōu)于Lip7和Lip8。酶學性質的基礎研究顯示:Lip2、Lip7、Lip8最適pH均為8.0;最適溫度分別為40℃、

4、40℃、50℃，論文從氨基酸組成上解釋了Lip8嗜熱的原因;不同金屬離子對三個脂肪酶活性的抑制或促進程度不同，其中Ni2+抑制作用最為明顯;Lip2偏向水解長鏈酯，而Lip7和Lip8偏向水解中鏈酯，并從空間結構解釋脂肪酶底物特異性存在差異的原因。以上性質上的差異，為后續(xù)三個脂肪酶的進一步研究和應用奠定基礎。
　　(3)由于大腸桿菌具有發(fā)酵周期短、培育成本低的優(yōu)勢，本文對脂肪酶在大腸桿菌中的異源表達進行初步探究。成功構建pET22

5、b-lip7重組質粒，并在大腸桿菌體系中實現(xiàn)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip7的異源表達。優(yōu)化了搖瓶階段發(fā)酵條件:在誘導時間為12 h，表達宿主為Rosetta，誘導溫度為20℃的發(fā)酵條件下，Lip7的水解酶活最佳，為0.29 U/mL。
　　(4)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2作為一種具有廣泛應用價值的脂肪酶，其熱穩(wěn)定性較差，阻礙其應用。本論文在實驗室前期改造基礎上，嘗試進一步提高Lip2的熱穩(wěn)定性。通過定點突變技術，成功構建Lip2三個突

6、變子T117G/C244A、F237C/C244A、T117G/F237C/C244A，并在畢赤酵母GS115中成功實現(xiàn)分泌表達。最終突變酶T117G/F237C/C244A的熱穩(wěn)定性最佳，在50℃下的半衰期大于100 min，相較于本實驗室前期改造的Lip2突變酶(14.4 min)，進一步提高了Lip2的熱穩(wěn)定性。通過對脂肪酶空間結構的分析，探討了突變酶熱穩(wěn)定性提高的機制，為深入了解解脂耶氏酵母脂肪酶家族結構與功能的關系提供了理論基