基于多酚氧化酶靶酶結(jié)構(gòu)的新型抑制劑先導(dǎo)化合物的合理設(shè)計(jì)與篩選.pdf

1、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一種由核編碼的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅的氧化還原金屬酶，催化酚類物質(zhì)的氧化，一種以Cu2+為輔基的氧化還原酶。在自然界中廣泛存在于植物、人體、動(dòng)物、微生物等各種生物體中。PPO是引起果蔬褐變的重要的酶之一，果蔬的褐變引起了很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，高效新型的PPO抑制劑的開(kāi)發(fā)具有重要的意義。
　　伴隨著計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、分子生物學(xué)和酶學(xué)等多領(lǐng)域的迅速發(fā)展，合理的藥物分子設(shè)計(jì)已成為新藥

2、研發(fā)的重要途徑。在本研究中，我們根據(jù)PPO結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，綜合運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、生物活性測(cè)定及有機(jī)合成等技術(shù)對(duì)其新型抑制劑先導(dǎo)化合物進(jìn)行虛擬篩選與合理設(shè)計(jì)、化學(xué)合成、生物活性測(cè)定。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　一、先導(dǎo)化合物的虛擬篩選方面:首先，由于藕的PPO目前晶體結(jié)構(gòu)未解析出來(lái)，我們采用甘薯PPO為模板，通過(guò)SWISS-MODEL同源模建得到藕的PPO蛋白的三維結(jié)構(gòu)。然后根據(jù)已知抑制劑與已報(bào)道的PPO酶結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合模式和作用機(jī)制為

3、模板，分析確定了Suflex-Dock和GOLD-Wizard兩種對(duì)接方法來(lái)進(jìn)行基于藕中PPO靶酶結(jié)構(gòu)的虛擬篩選。根據(jù)配體小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合構(gòu)象及結(jié)合力，從7萬(wàn)多個(gè)商業(yè)化的小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出24個(gè)潛在活性的化合物，通過(guò)Specs公司購(gòu)買這24個(gè)候選化合物，并進(jìn)行下一步的生物活性測(cè)定研究。
　　二、生物活性測(cè)定方面:利用紫外吸收分光光度計(jì)，通過(guò)測(cè)定410nm處的吸光度值來(lái)測(cè)定PPO的生物活性。對(duì)篩選得到的24個(gè)候選化合物進(jìn)行了酶

4、體水平的生物活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，18號(hào)化合物對(duì)PPO的活性抑制能力最強(qiáng)，其IC50值達(dá)到了0.14mg/mL，與已商品化的PPO抑制劑抗壞血酸的IC50值相當(dāng)(抗壞血酸為0.12mg/mL)，且18號(hào)化合物對(duì)接構(gòu)象及作用機(jī)制與參照結(jié)構(gòu)（苯基硫脲）類似。因此，我們將18號(hào)化合物作為先導(dǎo)化合物應(yīng)用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)研究。
　　三、先導(dǎo)化合物的優(yōu)化設(shè)計(jì)方面:根據(jù)PPO活性位點(diǎn)與抑制劑之間的作用機(jī)制，結(jié)合參照結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)

5、18號(hào)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的優(yōu)化設(shè)計(jì)，最終確定優(yōu)化后的目標(biāo)結(jié)構(gòu)為.-N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲。采用一鍋法合成21個(gè)目標(biāo)化合物，并進(jìn)行了IR、1H NMR結(jié)構(gòu)表征。利用同樣的生物活性測(cè)定方法，對(duì)得到的目標(biāo)化合物進(jìn)行生物活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A2的生物活性最高，其IC50值為0.015mg/mL，與先導(dǎo)化合物相比，抑制率增加了89.29％。
　　四、定量構(gòu)效關(guān)系方面:對(duì)合成的21個(gè)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)與其PPO活性數(shù)據(jù)之間進(jìn)行定量