牛胰組織蛋白酶L的酶學特性及對牛肌原纖維降解作用研究.pdf

1、嫩度是牛肉食用品質的最重要指標，由肌原纖維和肌內結締組織的結構和生化性質所決定。本研究利用蛋白質柱層析技術對牛胰中的組織蛋白酶L進行分離純化，在研究其酶學性質的同時，利用蛋白質凝膠電泳、透射電鏡、相差光學顯微鏡等手段觀察純化組織蛋白酶L對牛肌原纖維結構及蛋白水解變化，并討論了該純化酶對牛肉嫩化的潛在機制，為其宰后成熟嫩化的貢獻提供理論依據。具體研究內容和結果如下:
　　對牛胰組織蛋白酶L進行了純化制備及分子量鑒定。以新鮮牛胰為原料

2、，對組織蛋白酶L進行分離純化。牛胰勻漿物經酸化粗提，再通過鹽析、透析、濃縮、DEAESephacel陰離子交換、Sephacryl S-100分子排阻、SP Sepharose F.F.陽離子交換、BlueSepharose6 F.F.染料親和、ConA Sepharose親和柱層析等步驟純化，制備0.58 mg純酶，純化倍數(shù)達530.54。經SDS凝膠電泳分析，該酶的分子量被鑒定為29.1 kDa。
　　研究了牛胰組織蛋白酶L的

3、酶學性質。經試驗結果分析，牛胰組織蛋白酶L的最造反應溫度為50℃，活性溫度范圍為20-50℃，熱穩(wěn)定性隨溫度升高急劇下降，60℃幾無活性。最適反應pH為6.5，活性pH范圍為4.0～7.5，pH3.0～8.0處理1h均能保持70％以上活性。巰基還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、L-半胱氨酸均明顯激活了該酶活性，10μmol/L的N-(反式-環(huán)氧丁二?；?-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2+對酶

4、活性有明顯抑制。該純化酶可水解芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-MCA)，其Km值為3.52μmol/L，Vmax達到500U/mg;而對芐氧羰基-精氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-MCA)和L-精氨酰-甲基香豆素(L-Arg-MCA)不表現(xiàn)出水解活性。
　　牛胰組織蛋白酶L能降解多種牛肌原纖維蛋白，可破壞牛肉肌原纖維Z線結構。研究了純化牛胰組織蛋白酶L對牛背最長肌的肌原纖維的結構和蛋白降解