豬小腸黏膜肝素加工廢棄物中黏蛋白的提取分離、結構表征及免疫活性評價.pdf

1、本文以豬小腸黏膜肝素加工廢棄物為原料，分別采用60℃熱水、胰蛋白酶(EC3.4.21.4)、2709堿性蛋白酶(CAS:9014-01-1)、胃蛋白酶(CAS:9001-75-6)和枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.21.14)提取共獲得5種黏蛋白粗品，Ims-W、Ims-Y、Ims-YJ、Ims-A和Ims-N。它們的收率分別為0.30％、1.21％、4.03％、0.34％及1.22％。對5種黏蛋白粗品的基本理化性質進行分析，并采用反相高效

2、液相色譜法(RP-HPLC)對其單糖組成進行測定。結果表明，Ims-W、Ims-Y、Ims-YJ、Ims-A和Ims-N的重均分子量分別為1371kDa、1028kDa、665 kDa、684 kDa和839 kDa，蛋白含量分別為51.23％、27.24％、36.97％、56.78％和44.21％，硫酸根含量均低于5％。單糖組成分析表明5種黏蛋白粗品主要由氨基半乳糖(GalN)、氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc

3、)、N-乙酰神經氨酸(NeuAc)和N-羥乙酰神經氨酸(NeuGc)組成。因提取工藝不同，樣品中的唾液酸含量差別較大，NeuAc和NeuGc的含量一般在2.91％～17.58％及4.61％～12.71％之間。
　　對酶提樣品Ims-Y和Ims-YJ進一步純化并借助質譜手段進行結構表征。根據(jù)電荷密度分布不同，采用強陰離子交換層析從Ims-Y和Ims-YJ粗品中共得到六個純化組分，即Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-

4、1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0，它們的收率分別為73.21％、3.22％、5.35％、83.33％、1.67％和2.89％。理化性質分析結果表明，Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0的蛋白含量分別為20.34％、30.91％、10.90％、31.06％、10.78％和13.96％，硫酸根含量分別為3.43％、

5、8.71％、13.92％、3.16％、9.13％和17.21％，重均分子量分別為763kDa、24 kDa、31 kDa、658 kDa、21 kDa和22 kDa。RP-HPLC單糖組成分析表明，Ims-Y-0.6、Ims-Y-0.8、Ims-Y-1.0、Ims-YJ-0.6、Ims-YJ-0.8和Ims-YJ-1.0中均主要由GalN、GlcN、Gal和Fuc組成，其中Ims-Y-1.0和Ims-YJ-1.0還含有13％～16％的葡

6、萄糖醛酸(GlcA)。此外，Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6均含NeuGc和NeuAc，且它們的含量在11.82％～36.14％之間，而另外4個組分則不含NeuGc和NeuAc。進一步對黏蛋白Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6結構分析，首先采用還原β-消除法對Ims-Y-0.6和Ims-YJ-0.6進行O-糖鏈釋放，然后選擇Bio-gel P2凝膠滲透色譜對釋放的寡糖醇混合物進行分離。根據(jù)Bio-gel P2純化結果，采用

7、電噴霧碰撞誘導串聯(lián)質譜(ESI-CID-MS/MS)技術對Ims-Y-0.6中釋放的寡糖進行二級質譜分析。結合文獻中關于O-糖鏈結構解析質譜規(guī)律，利用特征離子，從核心結構類型，硫酸根、唾液酸、巖藻糖取代位置以及連接方式等方面確定了26個O-糖鏈結構，表明該樣品為高唾液酸化、GlcNAc C-6位硫酸根取代、抗原表位主要為Blood group H型的黏蛋白。
　　最后，本文采用Raw264.7細胞吞噬中性紅實驗，探討了從豬小腸黏膜