兩種節(jié)肢動(dòng)物纖溶蛋白酶基因克隆與表達(dá).pdf

1、纖溶性蛋白酶，是類(lèi)胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族中一類(lèi)非常重要的堿性蛋白酶，它們具有很好的纖溶活性，廣泛的存在于各種動(dòng)物、昆蟲(chóng)和微生物中。目前，一些纖溶性蛋白酶已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成用于治療血栓病的藥物。本文以蝎子和黃粉蟲(chóng)為研究對(duì)象，克隆了蝎子體內(nèi)的纖溶性蛋白酶基因，同時(shí)在大腸桿菌BL21(DE3)體內(nèi)成功的表達(dá)出了具有一定纖溶活性的黃粉蟲(chóng)纖溶性蛋白酶。
　　 作者根據(jù)一些已經(jīng)被克隆出來(lái)的纖溶酶的氨基酸序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并性引物，然后

2、克隆出了蝎子纖溶酶基因的部分保守片段。通過(guò)RACE法對(duì)該酶的3'端和5'端的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)拼接得到了纖溶酶基因的全長(zhǎng)序列。該序列全長(zhǎng)1427bp，其中包括由1176bp個(gè)堿基組成的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼了由391個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)序列。通過(guò)BLAST在NCBI上做同源性比對(duì)，該酶與其他物種的纖溶酶的序列相似性在30％～45％之間。我們通過(guò)相關(guān)的軟件對(duì)克隆到的序列進(jìn)行分析，該酶的N端含有由18個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)

3、肽，酶的分子量約為42KDa，具有典型的“催化三聯(lián)體”結(jié)構(gòu)。通過(guò)模擬它的三維空間結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)該酶在活性部位和底結(jié)合部位沒(méi)有剛性的α螺旋和β折疊，說(shuō)明該區(qū)域的柔性較高，這樣有利于酶參與催化反應(yīng)，符合“誘導(dǎo)契合”機(jī)制。
　　 我們采用pET32a+質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)體內(nèi)成功的表達(dá)了黃粉蟲(chóng)纖溶酶。通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的研究，獲得了如下的最佳培養(yǎng)條件:在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30℃，在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)中期（OD6

4、00約為0.6）添加終濃度為1.0mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，250rpm條件下?lián)u床誘導(dǎo)培養(yǎng)5h，即可獲得一定含量的可溶性目的蛋白。由于大多數(shù)的蛋白是以包涵體的形式存在，所以我們采用尿素對(duì)包涵體進(jìn)行變性處理，然后用GEHiTrapIMACFF5mL純化柱通過(guò)Ni2+與目的蛋白His標(biāo)簽的親和層析來(lái)分離變性蛋白，最后在透析袋中對(duì)純化到的變性蛋白進(jìn)行復(fù)性。通過(guò)變復(fù)性處理，我們得到了純度較高而且具有一定纖溶活性的表達(dá)蛋白。另外，本文也對(duì)黃粉蟲(chóng)纖溶