高效降解羽毛的微白黃鏈霉菌Fea-10的分離鑒定及其角蛋白酶基因的異源表達.pdf

1、角蛋白酶(keratinase)是一類可以降解頑固的角蛋白（如羽毛、羊毛、頭發(fā)等）的蛋白酶，廣泛存在于自然界中。角蛋白酶一般可以分類為絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。由于角蛋白不能被普通的蛋白酶降解，且數(shù)量巨大，每年都會有數(shù)百萬噸的含角蛋白廢棄物產生，但是它們并不會在自然界中堆積，這種要是角蛋白降解微生物產生的角蛋白酶將這些廢棄物分解，從而減輕了環(huán)境的負擔。目前，已知細菌、真菌和放線菌中均有可以產生角蛋白酶的菌株，古細菌中也有可以產生角蛋白酶

2、的報道。角蛋白降解微生物可以利用廉價的角質廢棄物作為培養(yǎng)基質來產生角蛋白酶，使得角蛋白酶具有較低的生產成本，且角蛋白酶在各種工業(yè)領域具有很好的應用，具有很高的利用價值。
　　本文在養(yǎng)雞場堆積羽毛的土壤中，分離得到了一株角蛋白降解菌Fea-10。經過初步鑒定，F(xiàn)ea-10為微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavus。Fea-10具有很高的角蛋白酶活性，可以完整的降解羽毛。
　　通過已知的角蛋白酶的N端序列，

3、在Fea-10基因組中找到兩個可能的角蛋白酶基因gm2886和gm2888。這兩個基因均由信號肽、前肽和成熟酶三個部分構成。將這兩個基因的完整基因分別構建在pET15b-SUMO載體上，轉入BL21(DE3)均不能表達;更換為pET28a載體和Rossta(DE3)宿主后，只有gm2888可以獲得無活性的包涵體表達;將這兩個基因去掉信號肽的酶原基因分別構建在pET22b載體上，轉入Rossta(DE3)，只有2886可以獲得可溶性表達，

4、但并沒有角蛋白酶活性。
　　考慮到可能鏈霉菌表達系統(tǒng)更適于鏈霉菌來源的角蛋白酶表達并折疊為有活性的成熟酶，使用鏈霉菌-大腸桿菌穿梭整合型質粒pSET152進行表達。表達宿主菌選擇微弱角蛋白酶活的密旋鏈霉菌ACT12。構建gm2886帶有原始啟動子和紅霉素啟動子的表達載體和gm2888帶有紅霉素啟動子的表達載體，分別接合轉移導入ACT12。使用牛奶平板初篩接合子，并使用TSBY培養(yǎng)基發(fā)酵降解圈大的接合子，使用硫酸銨沉淀后，檢測只有g