理化誘變提高乳酸菌STX2γ-氨基丁酸產(chǎn)量的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA具有降低血壓、改善睡眠、促進(jìn)生殖、預(yù)防和治療癲癇、安神鎮(zhèn)靜等作用，在食品、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。GABA的生產(chǎn)方法分為化學(xué)合成法、植物提取法及微生物發(fā)酵法。通過微生物發(fā)酵獲取GABA，具有條件溫和、供選菌株種類多、適合工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，近年來獲得國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。為了進(jìn)一步提高GABA產(chǎn)量，本研究以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)保存的一

2、株唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus)STX2為出發(fā)菌株，進(jìn)行理化誘變處理，包括紫外誘變、氮離子束注入、NTG誘變、LiCl誘變以及復(fù)合誘變。通過初篩和復(fù)篩得到高產(chǎn)GABA菌株，繼而研究了高產(chǎn)突變菌株細(xì)胞制備GABA條件，研究結(jié)果如下:
　　1.建立了紙層析定性初篩結(jié)合HPLC定量復(fù)篩，快速篩選出高產(chǎn)GABA菌株方法。紙層析定性檢測(cè)GABA是以正丁醇、冰乙酸、水體

3、積比4∶1∶3為展開劑，0.4％茚三酮為顯色劑，5μL細(xì)胞轉(zhuǎn)化液上樣層析，根據(jù)GABA層析斑點(diǎn)大小和顏色深淺，快速排除了低產(chǎn)及不產(chǎn)GABA菌株。將初步篩選獲得的高產(chǎn)菌株通過HPLC進(jìn)一步檢測(cè)GABA含量。以丹磺酰氯(DNS-Cl)為衍生劑，C18為分離柱，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，結(jié)果細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中的GABA獲得了很好的分離。建立了GABA系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，GABA濃度在0～50mmol/L線性相關(guān)性好，回歸方程為y=898.31x+12

4、75，R2=0.9963。在該液相條件下，檢測(cè)相對(duì)誤差為7.4％，回收率為98.861％。證明該液相條件分析方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中GABA含量。
　　2.通過紫外誘變、N+注入、NTG/LiCl誘變及復(fù)合誘變等手段對(duì)STX2進(jìn)行理化誘變育種處理，通過初篩及復(fù)篩獲取高產(chǎn)突變菌株并考察其穩(wěn)定性。經(jīng)過理化誘變處理，共篩選到高產(chǎn)菌株67株，選取其中18株進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)，從中篩選到一株高產(chǎn)GABA且遺傳穩(wěn)定菌株NTG-5

5、，其GABA轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)21.455±1.301mg/(g·h)，較原始菌株(13.821±1.077mg/(g·h))提高了55.23％。
　　3.通過單因素試驗(yàn)對(duì)影響GABA轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行考察，確定Cu2+濃度、L-谷氨酸鈉濃度、pH為關(guān)鍵因素，利用正交試驗(yàn)進(jìn)一步得到了細(xì)胞轉(zhuǎn)化GABA的最優(yōu)條件組合為:30mL發(fā)酵液離心獲得細(xì)胞，加入5mL初始pH4.5，含10mmol/L的CuCl2、200mmol/L的L-谷氨酸鈉底物緩沖