環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測變形桿菌屬的研究.pdf

1、分類號：至S：2Q2：壘密級：公玨單位代碼：!QQ墨魚學號：2QQ墨152環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測變形桿菌屬的研究ApplicationofLoopMediatedIsothermalAmplification(LAMP)inRapidDetectionofProteus學位申請人：王鵬指導教師：張偉教授學科專業(yè)：農產品加工及貯藏工程學位類別：農學碩士授予單位：河北農業(yè)大學答辯日期：二O一一年五月二十九日物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同

2、大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。另外，在反應中添加特異性環(huán)引物(100pprimer)能夠把擴增時間縮短到原來的一半，使反應速率極大地得到提高。近年來LAMP技術以其特異性強、等溫、靈敏、操作簡單、產物易檢測等優(yōu)點已經應用于食品安全檢測領域的多個方面。本研究針對變形桿菌屬atpD基因序列(AXl09601)進行分析，設計6條引物f2條內引物、2條外引物、2條環(huán)引物)，對普通變形桿菌和奇異變形桿菌進行檢測，優(yōu)化反應條件，驗證檢測的特異性和靈敏

3、度，應用于食品樣品的直接檢測，并用限制性內切酶Pspl406I酶切擴增產物，觀察酶切片段大小，驗證方法的正確性，建立了變形桿菌屬的LAMP檢測方法。為了確立最佳反應條件我們對LAMP反應體系進行了優(yōu)化。實驗表明溫度是LAMP的最大影響因素，而鎂離子和引物濃度比對反應影響不大。從而獲知外環(huán)內引物濃度比為1：2：6、Mg添加濃度為20mmol／L、反應溫度為61℃、反應時間為50min時檢測最靈敏。為評價該技術的特異性，我們同時對1株普通變

4、形桿菌、1株奇異變形桿菌和13株其它腸桿菌致病菌進行特異性試驗。結果表明僅變形桿菌屬DNA擴增產物在電泳后出現(xiàn)特異的梯狀條帶，進一步對該擴增產物進行酶切，結果也與預期相符。這表明LAMP技術對變形桿菌屬DNA的擴增是特異的。我們對原始模板進行梯度稀釋來測試其敏感性，實驗結果表明LAMP技術可以穩(wěn)定檢出變形桿菌DNA的下限為54CFU／mL。應用LAMP方法對豬肉樣品進行變形桿菌DNA檢測，并將結果與普通PCR法相比較。結果顯示，LAMP