克隆徐淮山羊SCD1基因及轉基因小鼠和轉基因綿羊的制備.pdf

1、硬脂酰輔酶A脫氫酶(Stearoyl-CoAdesaturase，SCD)是存在于內(nèi)質網(wǎng)膜上的跨膜蛋白酶，是一種微粒體蛋白酶，屬于脫氫酶家族。哺乳動物SCD基因的cDNA首次在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)，在小鼠中SCD存在4種異構體，分別是SCD1～SCD4，它們分別編碼355、358、359和352個氨基酸。在正常的飲食條件下，SCD1 mRNA在白色脂肪組織、褐色脂肪組織、瞼板腺、哈德腺和包皮腺中高度表達，并且在肝臟和心臟中可被高碳水化合物顯著

2、誘導。
　　SCD1是脂肪代謝中的重要酶，是催化由飽和脂肪酸(SFA)合成不飽和脂肪酸(MUFA)的限速酶，在脂肪酸生物合成中起著中心調(diào)節(jié)作用。脂類中飽和脂肪酸(SFAs)與不飽和脂肪酸(MUFAs)的比例影響脂蛋白代謝、生物膜流動性和信號傳導，進而與糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥、肥胖癥等多種疾病相關，因此SCD1在近年成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，SCD1可能影響奶中SFAs/MUFAs比率、肌間脂肪沉積和成分，是改善乳品品質和肌肉質量

3、的主要候選基因。肌間脂肪中不飽和脂肪酸含量的提高對于肉品質和肉風味的改善也有著重要影響，而且不飽和脂肪酸與人類健康也有密切的關系。本研究克隆出徐淮山羊SCD1基因CDS并對其進行了生物學信息分析，進行體外表達、亞細胞定位研究，最后通過睪丸注射法介導SCD1基因制備轉基因小鼠和轉基因綿羊。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.克隆SCD1基因、生物學信息分析及構建真核重組表達載體。設計擴增SCD1基因特異引物，采用RT-PCR方法從徐淮山羊脂

4、肪組織中克隆出SCD1基因cDNA。將擴增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體中，測序與酶切結果表明pMD19-T-SCD1構建正確。將SCD1基因克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，構建重組真核表達載體pEGFP-SCD1，酶切與測序結果均表明pEGFP-SCD1構建正確。生物信息學分析結果表明:徐淮山羊SCD1基因CDS區(qū)共有1074bp，編碼357個氨基酸，蛋白分子量大小為41.35kDa，等電點為7.0，GenBank登錄號為JX85

5、4036。徐淮山羊SCD1基因序列和氨基酸序列與GenBank上報道的人、褐家鼠、小家鼠、綿羊、山羊、牛和野豬進行同源性比較，可知該基因在不同物種之間有較高的保守性。
　　2.重組真核表達載體pEGFP-SCD1體外表達及其亞細胞定位研究。采用脂質體重組融合表達載體pEGFP-SCD1轉染NIH-3T3細胞，48h后在熒光倒置顯微鏡下直接觀察綠色熒光在細胞中的位置，并提取細胞總RNA。用軟件預測和RT-PCR方法鑒定該融合蛋白在細

6、胞中的表達情況。軟件預測結果顯示SCD1蛋白主要在細胞質中表達。在倒置熒光顯微鏡下觀察，重組SCD1蛋白的熒光分布在細胞質內(nèi)，細胞核內(nèi)無熒光;RT-PCR結果顯示重組表達載體在NIH-3T3細胞中得到表達。
　　3.制備攜帶SCD1基因的轉基因小鼠。通過睪丸注射法，將攜帶有徐淮山羊SCD1的重組載體轉入雄性小鼠睪丸內(nèi)，然后將雄鼠和空懷母鼠合籠，獲得F1代小鼠，經(jīng)過DNA和蛋白水平檢測，最終獲得6.67％的陽性個體。將F1代陽性個體