內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在TXNIP誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：
　　糖尿?。―iabetes Mellitus）已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)成為危害人類身體健康的一大殺手。糖尿病分為胰島素依賴的1型和進(jìn)展較慢、可長期不依賴胰島素治療的2型，但無論哪種類型糖尿病最終都會出現(xiàn)β細(xì)胞的損傷和凋亡，并最終導(dǎo)致胰島功能的失代償，而不得不進(jìn)入胰島素依賴期。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型和高糖高脂培養(yǎng)的成鼠心肌細(xì)胞中， TXNIP（Trx interacting protein）的表達(dá)

2、顯著增加，同時心肌細(xì)胞的損傷和凋亡也增加，RNA干擾抑制TXNIP表達(dá)后，細(xì)胞凋亡的發(fā)生顯著減輕，提示TXNIP的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前TXNIP已經(jīng)被認(rèn)為是在β細(xì)胞的生理功能和糖尿病的藥物治療上的一個關(guān)鍵分子。
　　研究表明，在2型糖尿病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress）參與了β細(xì)胞的凋亡。由于在ER中大量未折疊的蛋白會激活未折疊蛋白反應(yīng)，如果這個問題一直存在的話就

3、會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過PERK（protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase）、IRE1α（inositol-requiring protein-1α）、ATF6α（activating transcription factor6α）3條通路從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　目的：
　　本研究旨在用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞內(nèi)的TXNIP蛋白高表達(dá)，觀察過表達(dá)的TXNIP本身是否可以引起正常糖脂濃

4、度條件下的INS-1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，重點(diǎn)研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了TXNIP誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的下游機(jī)制進(jìn)行分析。
　　方法：
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組和腺病毒轉(zhuǎn)染：將在正常糖脂濃度下培養(yǎng)并處于對數(shù)生長期的INS-1細(xì)胞分為三組，分別是正常培養(yǎng)（Normal）組，空病毒（Ad-eGFP）組，過表達(dá)（Ad-TXNIP-eGFP）組，按照感染復(fù)數(shù) MOI=50計算出轉(zhuǎn)染組需要的病毒量，取各組所需的病毒量

5、分別加入到1ml1640培養(yǎng)基中混勻，加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，對照組直接加入1ml1640培養(yǎng)基，4h后補(bǔ)3mL1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分別于24h，48h換液處理，并于熒光顯微鏡下觀察拍照。
　　(2)觀察轉(zhuǎn)染率：通過對同一個視野下帶綠色熒光蛋白的細(xì)胞所占的比例進(jìn)行計算，分別計算出Ad-eGFP組和Ad-TXNIP-eGFP組INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率，觀察到48h時的細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染效率最高，收集此時的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)

6、驗(yàn)。
　　(3) Real-time PCR實(shí)時熒光定量方法測定病毒轉(zhuǎn)染后INS-1細(xì)胞TXNIP、ATF5、XBP-1 mRNA的表達(dá)量。
　　(4)Western Blot方法測定病毒轉(zhuǎn)染后，INS-1細(xì)胞TXNIP、CHOP、p-PERK、PERK、ATF6、IRE1α、p-IRE1α、ATF5蛋白的表達(dá)。
　　(5) ELISA方法檢測Caspase-3、Caspase-12的表達(dá)量。
　　(6)流式細(xì)胞

7、術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后INS-1細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染效率的觀察和計算：
　　如圖2-1-1、2-1-2所示，用熒光顯微鏡觀察并分別計算出Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率分別為(12.21±5.58)％、(40.22±3.47)%，Ad-TXNIP-eGFP組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h的轉(zhuǎn)染率分別為（12.66±2.80)%、（41.28±3.84)%。由此可以看出無論Ad-eGFP組或Ad

8、-TXNIP-eGFP組48h的轉(zhuǎn)染率均高于24h（P<0.01），所以選用48h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。48h時Ad-eGFP組和Ad-TXNIP-eGFP組的轉(zhuǎn)染率沒有顯著性差異（P>0.05），說明各組轉(zhuǎn)染病毒量達(dá)到一致。
　　2、腺病毒載體構(gòu)建、TXNIP轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞成功
　　2.1TXNIP mRNA的表達(dá)量明顯升高
　　圖2-2-1、2-2-2顯示，與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞TXN

9、IP表達(dá)量沒有顯著性差異（0.73±0.40 vs.1.00±0， P>0.05）；與 Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP表達(dá)量明顯增高（16.56±2.99 vs.0.73±0.40，P<0.01），說明病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　2.2 TXNIP蛋白表達(dá)量也明顯增高
　　圖2-3-1、2-3-2中，與正常組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞TXNIP蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異（0.154±

10、0.029 vs.0.156±0.017， P>0.05）；與 Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組 TXNIP蛋白表達(dá)量明顯增高（0.527±0.089 vs.0.154±0.029， P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、目的基因過表達(dá)成功。
　　3、過表達(dá)TXNIP可以引起INS-1細(xì)胞凋亡增加
　　3.1 Caspase-3表達(dá)量明顯增高
　　Ad-eGFP組與對照組相比，INS-1細(xì)

11、胞Caspase-3表達(dá)量沒有明顯差異（0.80±0.18 vs.0.68±0.26,單位：μg/ml，P>0.05）;與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-3表達(dá)量明顯增高（2.50±0.49 vs.0.80±0.18，單位：μg/ml，P<0.01），見圖2-4。Caspase-3代表了細(xì)胞凋亡的終末途徑，Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-3表達(dá)量增高，說明過表達(dá)TXNIP可導(dǎo)致INS-1細(xì)胞凋

12、亡增加。
　　3.2流式法檢測過表達(dá)TXNIP組INS-1細(xì)胞凋亡率增加
　　Ad-eGFP組與正常組相比，INS-1細(xì)胞凋亡相對活性沒有明顯差異（11.77±1.20 vs.10.18±1.57，P>0.05）;與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組INS-1細(xì)胞凋亡率增加（30.79±3.53 vs.11.77±1.20，P<0.01），如圖2-5-1、2-5-2示，進(jìn)一步驗(yàn)證了過表達(dá)TXNIP可使INS-1

13、細(xì)胞凋亡增加。
　　4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡
　　4.1 CHOP蛋白表達(dá)量增高
　　結(jié)果顯示，同正常組相比較，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)量沒有明顯差異（0.21±0.04 vs.0.20±0.03，P>0.05）；與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組CHOP蛋白表達(dá)量增高（0.36±0.06 vs．0.21±0.04，P<0.05），見圖2-6-1、2-

14、6-2。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的一個重要分子，它在線粒體通路和死亡受體通路中不被激活，所以它能反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路引起的細(xì)胞凋亡，TXNIP過表達(dá)組CHOP蛋白表達(dá)量增高，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路介導(dǎo)了TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　4.2 Caspase-12表達(dá)量增高
　　與CHOP蛋白表達(dá)量變化一致，圖2-7中，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞Caspase-12表達(dá)量沒有明顯差異(0.46±0.07 vs．0.46

15、±0.05,單位：1×10-4μg/ml，P>0.05)；與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-12表達(dá)量增高（1.35±0.13 vs．0.46±0.07，單位：1×10-4μg/ml，P<0.05）。Caspase-12同CHOP蛋白一樣，都只是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中被激活，反映了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，TXNIP過表達(dá)組 Caspase-12表達(dá)量增高，進(jìn)一步顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可以參與TXNIP引起I

16、NS-1細(xì)胞的凋亡。
　　5、ATF6α蛋白通路不參與TXNIP引起的INS-1凋亡
　　Ad-eGFP組和正常組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞ATF6α蛋白表達(dá)量沒有明顯改變（0.54±0.05 vs．0.52±0.08，P>0.05），與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組ATF6α蛋白表達(dá)量也沒有明顯變化（0.57±0.06 vs．0.54±0.05，P>0.05）。說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的ATF6α蛋

17、白通路不參與過表達(dá)TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡,圖2-8-1、2-8-2。
　　6、PERK蛋白通路可能參與了TXNIP引起的INS-1凋亡
　　6.1 PERK蛋白磷酸化升高
　　結(jié)果顯示，圖2-9-1、2-9-2，與正常組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞p-PERK/PERK沒有明顯改變（0.51±0.12 vs．0.51±0.11，P>0.05），與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組p-P

18、ERK/PERK比值增高（0.73±0.12 vs．0.51±0.12，P<0.05）。提示PERK蛋白通路可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　6.2ATF5 mRNA的表達(dá)量升高
　　圖2-10-1、2-10-2顯示，同正常組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞ATF5 mRNA沒有明顯改變（0.93±0.26 vs．1.00±0，P>0.05），與 Ad-eGFP組相比 Ad-TXNIP-eGFP組ATF

19、5 mRNA增高（1.63±0.22vs．0.93±0.26，P<0.05）。ATF5是PERK通路下游信號中的一個重要分子，過表達(dá)組ATF5 mRNA的表達(dá)量升高說明PERK-ATF5這一通路可能參與了TXNIP引起的INS-1凋亡。
　　6.3 ATF5蛋白的表達(dá)量也升高
　　圖2-11-1、2-11-2中可以看出，與正常組比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞ATF5 mRNA沒有明顯改變（0.50±0.05 vs．0.4

20、8±0.04，P>0.05），與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組ATF5 mRNA增高（0.68±0.11vs．0.50±0.05，P<0.05）。進(jìn)一步說明了PERK-ATF5這一通路參與了TXNIP使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的的INS-1凋亡。
　　7、IRE1α蛋白通路不參與TXNIP引起的INS-1凋亡
　　7.1 IRE1α蛋白磷酸化變化不明顯
　　Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞p-IRE1α/IRE1

21、α沒有明顯改變（1.90±0.28 vs．1.92±0.29， P>0.05），與 Ad-eGFP組相比 Ad-TXNIP-eGFP組 p-IRE1α/IRE1α也沒有明顯變化（1.94±0.30 vs．1.90±0.28，P>0.05），見圖2-12-1、2-12-2。說明IRE1α蛋白通路可能不參與過表達(dá)TXNIP使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　7.2sXBP-1 mRNA變化不明顯
　　XBP-1是IRE1

22、α通路下游的一個重要分子，從圖2-13-1、2-13-2可以看出，與正常組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞sXBP-1 mRNA沒有明顯改變（0.96±0.17vs．1.00±0， P>0.05），與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組sXBP-1 mRNA變化不明顯（1.00±0.17 vs．0.96±0.17，P>0.05）。剪接后的sXBP-1 mRNA沒有明顯變化，提示IRE1α對XBP-1的內(nèi)切酶活性并沒有變化

23、，進(jìn)一步說明了TXNIP過表達(dá)中IRE1α蛋白通路不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　(1)單純過表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)下的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　(2)引起細(xì)胞程序性死亡的三條通路中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可以參與 TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡。
　　(3)在TXNIP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的三條蛋白通路中，PERK通路參與了這一過程，其余兩條ATF6α通路