草莓乙烯受體反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、草莓(Fragaria ananassa Duch)是一種重要的小型漿果，在世界范圍內(nèi)廣泛栽種，近年來育出很多優(yōu)良品種，種植面積逐漸擴大。然而仍有很多因素限制了草莓生產(chǎn)的發(fā)展，其中一個重要難題就是草莓果實難以保鮮、不耐貯運?；蚬こ碳夹g(shù)為植物育種、種質(zhì)資源開發(fā)利用等領(lǐng)域開辟了新的途徑，可以獲得常規(guī)育種難以或無法得到的新類型。 果實成熟是一個復(fù)雜的生理生化過程，而乙烯是引發(fā)果實成熟的主要因素之一。乙烯能從其生物合成和感知與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、兩方面進行調(diào)控，相對于人們對乙烯生物合成途徑的了解而言，有關(guān)植物感知乙烯及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的知識了解甚少，目前對乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究主要集中在擬南芥上。草莓是非躍變型果實，也能產(chǎn)生乙烯，某些情況下乙烯可能參與草莓的成熟，乙烯和草莓成熟之間的關(guān)系，不同的試驗得出的數(shù)據(jù)彼此矛盾，目前并沒有明確的結(jié)論，至今沒有結(jié)果明確表明乙烯和非躍變型果實成熟的關(guān)系。乙烯感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的初始成分是乙烯受體，乙烯的生理作用最終是通過乙烯受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程完成的。

3、目前草莓上分離出3個乙烯受體基因，本試驗采用反義RNA技術(shù)試圖了解乙烯在草莓果實成熟衰老中的作用及這些乙烯受體的功能和作用方式。 本試驗對草莓組織培養(yǎng)體系進行了系統(tǒng)研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系。構(gòu)建了草莓反義乙烯受體表達載體pBI121Etr1、pBII21Ers1和pBII21Etr2及同時含有草莓乙烯受體FaEtr1和FaErs1的雙價植物表達載體pFRS，用于轉(zhuǎn)化草莓，成功的獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并進行了相關(guān)分子生

4、物學(xué)鑒定，獲得反義轉(zhuǎn)基因材料對探討乙烯受體作用以及乙烯在草莓等非躍變型果實成熟的調(diào)控機理具有重要意義，也為后續(xù)研究提供了寶貴的試驗材料。 1.在已報道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計特異引物，分別克隆草莓乙烯受體FaEtr1基因580 bp部分特異序列、FaErs1基因445 bp部分特異序列和FaEtr2基因345 bp部分特異序列，將上述3個片段分別反向插入植物表達載體pBII21的CaMV3

5、5s啟動子和Nos終止子之間，構(gòu)建了反義表達載體pBI121Etr1、pBII21Ers1和pBII21Etr2。將帶有完整啟動子和終止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中，最終獲得FaEtr1和FaErs1的雙價植物表達載體pFRS。通過PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組質(zhì)粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。將這4個重組表達質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，PCR及限制

6、性內(nèi)切酶酶切確定質(zhì)粒已被導(dǎo)入。 2.以‘豐香’、‘鬼露甘’、‘全明星’、‘嫜姬’、‘哈利’、‘幸香’6個草莓品種為試材，研究了影響草莓不定芽再生的各種因素，建立離體葉片高效再生系統(tǒng)。結(jié)果表明，外植體基因型、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比、葉齡等是影響草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘’葉片最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1，‘嫜姬’葉片愈傷組織的誘導(dǎo)以MS+6-BA 3 mg.L-1+2

7、,4-D 0.2 mg.L-1較好；芽伸長的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg.L-1+IBA 0.5 mg.L-1；生根的最適培養(yǎng)基為MS+IBA 0.2 mg.L-1，試管苗移栽后成活率為87％。另外，1W左右的暗培養(yǎng)可以防止外植體的褐化。 3.利用帶有內(nèi)含子的gus基因的瞬時表達，研究影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)‘鬼露甘’草莓遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素。結(jié)果表明：草莓葉片外植體對卡那霉素較為敏感，適宜的篩選濃度為20 mg.L-1，可明

8、顯抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長；300 mg.L-1的羧吩青霉素可有效抑菌，對外植體生長影響也較小；預(yù)培養(yǎng)2～4d有利于轉(zhuǎn)化：共培養(yǎng)2～3d有利于提高轉(zhuǎn)化頻率并避免了農(nóng)桿菌的過度生長；OD600nm值為0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株經(jīng)PCR檢測初步證明gus基因已成功整合到草莓基因組中。 4.通過根癌農(nóng)桿菌EHA105將含有反義FaEtr1和.FaErs1基因的雙價植物表達載體pFRS導(dǎo)入草莓，經(jīng)卡那霉素選擇壓下連續(xù)分化選

9、擇、擴繁和生根培養(yǎng)并經(jīng)PCR和Southern blot檢測證明，其中15株的基因組已成功導(dǎo)入和整合反義FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明，轉(zhuǎn)入的反義基因?qū)Π谢蚨加胁糠值囊种啤?通過根癌農(nóng)桿菌EHA105將含有反義FaEtr2基因的植物表達載體pBI121Etr2導(dǎo)入草莓，經(jīng)卡那霉素選擇壓下連續(xù)分化選擇、擴繁和生根培養(yǎng)，并經(jīng)PCR和Southern blot檢測證明，其中26株的基因組已成功導(dǎo)入和整合反義