基于聚合物-藥物多重相互作用的高效納米傳輸系統(tǒng)研究.pdf

1、許多重要的治療藥物由于極小的水溶性限制了其在臨床上的廣泛應用，因此開發(fā)有效的傳遞系統(tǒng)是一項十分重要的工作。作為理想的藥物傳遞系統(tǒng)，它必須能夠將藥物轉運至體內特定部位，并在該部位釋放其中的藥物。同時，載體本身應無毒或能夠降解為無毒產物并從體內消除。兩親性共聚物通過自組裝形成的聚合物組裝體作為新一代藥物傳輸系統(tǒng)近年來備受研究人員的青睞,廣泛用于小分子藥物、多肽、蛋白以及基因等治療藥物的傳輸。
　　 近年來合成化學的發(fā)展大大推動了智能

2、型聚合物膠束的設計、制備，這些系統(tǒng)能夠靶向特異的病灶部位并在外部刺激作用下釋放藥物。到目前為止，已有6個以上聚合物納米組裝體系統(tǒng)作為抗癌藥物的納米給藥系統(tǒng)正在進行臨床研究，其中涉及的抗癌藥物有阿霉素、紫杉醇及喜樹堿等藥物。不過，聚合物組裝體作為疏水藥物的傳輸系統(tǒng)，具有載藥量較低的缺點，直接影響其后期治療效果、甚至正常療效的發(fā)揮。一般而言，難溶性藥物通過疏水作用包封于聚合物組裝體的疏水微區(qū)，這種藥物/聚合物分子間單一的非共價鍵力是導致藥物

3、負載量較低的主要原因。為了解決該類藥物傳輸系統(tǒng)所面臨的這一問題，本課題提出通過聚合物和藥物間的多重非共價鍵作用可以提高聚合物納米組裝體的藥物負載性能這一假設。為了驗證該假設，本研究設計、合成了β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)，并選用吲哚美辛(IND)作為模型藥物。由于PEI-CD 同時含有伯胺、仲胺、叔胺及β-環(huán)糊精單元，該材料與吲哚美辛之間同時存在靜電、氫鍵及主客體相互作用。此外，藥物分子本身的疏水基團介導的疏水作用也有利于高

4、效藥物負載系統(tǒng)的構建。
　　 通過對甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精(6-Monotosyl β-cyclodextrin)與聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)之間的親核取代反應來合成PEI-CD。聚合物PEI-CD的結構通過紅外光譜(FT-IR)和核磁共振光譜(1H-NMR)來確定。聚合物組成，即聚合物中β-CD取代量，通過1H-NMR 測定來計算得到。
　　 在此基礎上，通過PEI-CD和IND 之間

5、的多重非共價鍵相互作用構建了殼-核型納米組裝體，作為高效藥物傳輸系統(tǒng)，其中多重非共價鍵作用主要包括靜電作用、氫鍵、主客體相互作用以及疏水作用。采用改良的透析法來制備IND/PEI-CD 納米組裝體。
　　 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對不同投藥比制備的組裝體的形態(tài)進行觀察。藥物與聚合物之間的非共價鍵相互作用通過紅外光譜(FT-IR)、核磁共振光譜(NMR)進行表征。
　　 藥物分子在組裝體中的存在形式通過差示掃

6、描量熱法(DSC)、X-射線衍射法(XRD)測定和激光共聚焦顯微鏡(CLSM)進行觀察。紫外分光光度法測定吲哚美辛載藥量和包封率，表明其載藥量最高可達到71％。此外，PEI-CD與含有羧基的其他疏水性藥物，如布洛芬、二氟尼柳、氟比洛芬和萘普生等也能自發(fā)形成納米組裝體系統(tǒng)，載藥量可達到50％以上。選用環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物和聚乙二醇-聚（L-乳酸）共聚物進行的對照實驗表明，環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物膠束系統(tǒng)的載藥量最高僅為22.9％，而聚

7、乙二醇-聚（L-乳酸）共聚物膠束系統(tǒng)的載藥量最高為18.9％。體外釋放動力學研究顯示，IND/PEI-CD 自組裝體在pH 7.4的釋放介質中24 h內可釋放90％；模擬胃腸道環(huán)境中，在胃液（pH 1.2）中IND 釋放量極少,而轉移至模擬腸液(pH 7.4)中后，藥物在24 h內仍能釋放90％以上，與此相比，相同條件下原料藥僅能釋放22％。大鼠灌胃給藥后，IND/PEI-CD 納米組裝體系統(tǒng)能維持藥物較高的濃度長達4天，且其血藥濃度-

8、時間曲線下面積(AUC)是原料藥組的9倍。
　　 方法
　　 1.Β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺的合成通過對甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精(6-Monotosyl β-cyclodextrin)與聚乙烯亞胺（PEI）之間的親核取代反應來合成β-環(huán)糊精鍵合PEI，即PEI-CD。
　　 2.聚合物結構表征和組成測定聚合物的結構通過核磁共振光譜(1H-NMR)來確定。聚合物組成，即聚合物中β-CD取代量，通過1H-NMR 測定

9、來計算得到。
　　 3.藥物/PEI-CD組裝體微粒的制備采用改良的透析法制備載藥組裝體納米微粒。具體而言，將溶于水溶性有機溶劑中的藥物溶液在超聲作用下加入PEI-CD(10mg/ml)水溶液中，得到的混合體系在水溶液中透析即可得到載藥組裝體水溶液。其中涉及的藥物包括吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬。
　　 4.載藥組裝體中藥物含量的測定精密稱取一定量的載藥組裝體，將其分散于3 ml 乙醇溶液中，渦旋1min

10、后于8000rpm 離心10min，之后取出上清，如此重復3次后將上清液合并至10ml 容量瓶中定溶，一定波長處測定其吸光度。吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬測定波長分別為310nm、271nm、306 nm、273 nm、287 nm。按以下公式分別計算載藥量與包封率。
　　 載藥量(％)=×100％組裝體中所含藥物量(mg)組裝體總量(mg)包封率(％)=×100％ 載藥量(％)理論載藥量(％)5. 藥物-聚合物

11、間多重相互作用的表征將藥物、聚合物、藥物聚合物物理混合物、載藥組裝體分別進行紅外光譜(FT-IR)和核磁共振光譜(NMR)測定，以分析其多重相互作用力的存在。
　　 6. 載藥組裝體形態(tài)學及表面電位測定采用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)及原子力顯微鏡(AFM)來觀察微粒形貌。動態(tài)光散射法(DLS)測定載藥組裝體的粒徑大小。表面電位分析儀測定載藥組裝體表面所帶電荷情況。
　　 7. 載藥組裝體中藥物存在

12、形式的表征通過差示掃描量熱儀(DSC)和X-射線衍射儀(XRD)測定以及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察，分析載藥組裝體中藥物的存在形式和分布行為。
　　 8. 載藥組裝體的表面修飾通過在組裝體中引入金剛烷基末端改性的聚乙二醇(PEG-Ada)實現(xiàn)其表面的PEG化，提高膠體穩(wěn)定性和再分散性。將溶于DMSO中的IND溶液在超聲作用下加入含有PEI-CD和PEG-Ada的水溶液中，得到的混合液在水溶液中透析即可得到表面PEG修飾的載

13、藥組裝體。
　　 9. 體外藥動學研究取0.5 ml 載藥組裝體水溶液進行體外釋放實驗，同時稱取一定量的吲哚美辛原料藥、片劑作為對照。釋放分別在兩種不同的介質中進行：1)pH 7.4的PBS 緩沖液；2)模擬口服后胃腸道環(huán)境在pH 1.2和pH 7.4中進行。計算累計釋放百分率，并繪制藥物累積釋放曲線。
　　 10. 體內藥動學研究大鼠灌胃給藥后，預定時間點采集血樣，3000rpm 離心10min 取血漿。血漿處理方法為

14、，50μl 血漿中加入100μl 乙腈和400μl 甲滅酸內標液（乙腈為溶劑）后渦旋1min，8000rpm 離心10min后取上清，氮氣下吹干后加入100μl 流動相渦旋1min后進樣，通過HPLC 測定藥物濃度。流動相為乙腈-6 μM H3PO4水溶液(55:45，v:v)，流速1ml/min，柱溫40℃，檢測波長245 nm，進樣量20μl，色譜柱采用C18 反相柱。
　　 使用DAS 軟件處理藥物濃度數(shù)據。
　　

15、 11. 載藥組裝體在腸道內滯留時間及其對胃腸道刺激研究使用熒光標記聚合物FITC-PEI-CD 制備IND 載藥組裝體，大鼠灌胃給藥后，預定時間點將其處死取胃腸道組織。HE 染色后顯微鏡下觀察胃腸道刺激情況，熒光顯微鏡下觀察載藥組裝體在腸道內的滯留情況。
　　 結論
　　 1.通過對甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精與聚乙烯亞胺之間的親核取代反應成功合成了具有伯胺、仲胺、叔胺和β-環(huán)糊精單元的親水性聚合物PEI-CD。2. 含

16、有羧基的疏水性藥物與PEI-CD 間的多重非共價鍵作用可以介導核-殼型載藥組裝體的形成；與傳統(tǒng)的僅通過疏水作用形成的載藥膠束相比，本研究制備的納米組裝體系統(tǒng)具有更高的藥物負載能力。從而證實了本課題提出的假設，即通過載體材料和藥物分子之間的多重非共價鍵作用可以制備高載藥組裝體納米系統(tǒng)。
　　 3.IND/PEI-CD 自組裝納米微粒經表面PEG 修飾后可使組裝體在水溶液中的膠體穩(wěn)定性和再分散性大大提高。同時，這一組裝體可以作為其他