多重PCR快速檢測三種食源性致病菌的研究.pdf

1、近年來，全球食品安全事件頻發(fā)，突發(fā)事件頻率高是食品安全問題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，在這些事件中，病原菌的污染是引起食源性疾病的主要因素之一。加強(qiáng)食品檢驗(yàn)力度是有效預(yù)防病原菌傳播及食品中毒的最有效途徑。目前，食源性致病微生物主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，即分離、培養(yǎng)然后生化鑒定，操作繁瑣，檢測時(shí)間較長，通常需4-7d才能完成，且每次只能檢出一種致病菌，靈敏度較低。近年來，PCR技術(shù)發(fā)展十分迅速。多重PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)對多種致病微生物的

2、檢測，具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究建立了食品中單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌的多重PCR檢測技術(shù)。
　　本文根據(jù)單增李斯特氏菌的基因hlyA、金黃色葡萄球菌的nuc和變形桿菌的atpD基因設(shè)計(jì)了3對特異性引物，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)對三種致病菌的同時(shí)檢測。對其擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與Genebank上目的序列進(jìn)行同源性比對，以驗(yàn)證三對引物的特異性。本研究選取大量菌株進(jìn)行性特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的單增李斯特

3、氏菌、金黃色葡萄球菌及變形桿菌引物均能特異性地?cái)U(kuò)增出174bp、238bp、508bp的目的片段，其他菌株均為陰性。還進(jìn)一步將三種菌株DNA進(jìn)行隨機(jī)組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)檢測其反應(yīng)的特異性，結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出特異性目的片段。由此可知，多重PCR檢測方法特異性強(qiáng)，可用于同時(shí)檢測三種致病菌的一種或幾種。
　　本研究對多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)過程中對鎂離子和引物的添加量、dNTP的添加量、Taq酶的添加量、和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。

4、最終確定了多重PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)體系：10×Easy Taq Buffer（-Mg2+）2.5μL，2.5mM dNTPs2μL，50mM MgSO41μL，單增李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的上下游引物各1.5μL(10μmol/L)，變形桿菌的上下游引物1.0μL(10μmol/L)，模板DNA2μL，5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase0.5μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?/p>

5、：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，63.1℃退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。
　　本研究共檢測了13株菌，2株變形桿菌、2株金黃色葡萄球菌、1株單增李斯特菌均為陽性結(jié)果；8株其它腸桿菌均為陰性結(jié)果，從而驗(yàn)證多重PCR引物特異性。將三種致病菌隨機(jī)混合，加入3對引物進(jìn)行擴(kuò)增，均能夠特異性擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，從而證實(shí)該多重PCR反應(yīng)特異性較強(qiáng)。
　　本方法對三種食源性致病菌純菌培養(yǎng)物單菌檢測靈敏度均為103c