siRNA成藥性的化學研究：普適堿基修飾以及新型納米給藥體系構建.pdf

1、RNA干擾技術(RNAi)于2006年獲得了諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。小干擾RNA（siRNA）不僅僅是一種出色的分子生物學研究手段，更重要的是，它是一種潛在的具有藥物應用前景的生物分子。近年來，siRNA的藥物應用成為科研機構和企業(yè)的研究熱點。經(jīng)過近10年的研究，siRNA的藥物應用依然沒有一例通過美國食品和藥物管理局(FDA)的批準而上市。這是因為其還面臨著一系列的挑戰(zhàn):穩(wěn)定性差，存在脫靶效應，毒性和免疫反應，給藥體系建立困難等。本文就

2、siRNA的藥物應用的性質改善作出了嘗試。
　　第一部分，針對脫靶效應的問題對siRNA的堿基進行了5-硝基吲哚的修飾。脫靶效應是siRNA在作為藥物時必須面對的問題。一般來說，siRNA由正義鏈（sense strand）和反義鏈(antisense strand)構成。其中，反義鏈在RISC(RNA-induced silencing complex)復合物與靶mRNA(target siRNA)進行互補識別，將其切割。而正義

3、鏈又名passenger strand，它攜帶反義鏈進入RNAi通路后，由于化學結構的相似性，同樣會組裝成為有效RISC，進行我們不希望看到的mRNA切割。針對這一問題，我們設計了一種被稱為普適堿基(universal base)的5-硝基吲哚的堿基修飾。通過6步有機合成，我們得到了亞磷酰胺單體并用于固相合成，得到了共45條單5-硝基吲哚修飾的siRNA。通過熔鏈溫度的測定，我們發(fā)現(xiàn)單個的5-硝基吲哚不會引起修飾雙鏈較大程度的熱力學穩(wěn)定

4、性降低。通過圓二色譜的檢測，我們確定單個的5-硝基吲哚修飾不會引起大程度的雙鏈整體構象變化，依然保持著A構型RNA雙鏈結構。用螢火蟲雙熒光素酶報告系統(tǒng)，我們系統(tǒng)性地檢測了基于siNPY305和siKIP04序列的38個逐點修飾的siRNA的不同位點修飾對干擾效果的影響;并發(fā)現(xiàn)當單個5-硝基吲哚修飾于正義鏈15位時，可以使得正義鏈的干擾效果極大程度降低，而反義鏈的干擾效果得到保持甚至少許提升。通過共計九條不同siRNA序列的修飾，我們確定

5、5-硝基吲哚用于正義鏈15位的修飾可以作為一種普適的方法用于有效降低正義鏈引起的脫靶效應。這些結果對于今后設計更有效而精確的siRNA提供了一種可行的方式。
　　第二部分，我們研究了一種全新的siRNA納米顆粒的構建方法。利用納米尺寸載藥體系進行siRNA給藥已經(jīng)被證實是有效的。因為有研究證明，在某些組織中，如肝臟腎臟和一些腫瘤中，只有在5nm到200 nm之間大小的納米顆粒才可穿過其毛細血管內皮。但在構建包含siRNA的納米顆粒

6、時通常作為藥效團的siRNA含量較低，含有大量輔料，如何構建高siRNA載量的納米顆粒，降低由輔料帶來毒性或免疫反應的可能性，是siRNA藥物應用中亟待解決的科學問題。我們希望通過最少的化學修飾直接將siRNA構建為納米顆粒。經(jīng)過設計，我們通過簡單的三聯(lián)體RNA，通過條件控制，構建了良好分散的，尺度控制（直徑30nm左右）的阿基米德立體RNA納米顆粒。它具有極高的siRNA載量(87％，質量比)，輔料極少。這種納米顆粒具有良好的生物學功

7、能。我們通過體外實驗驗證了這種球形顆粒能夠被體外重組的Dicer酶切割生成siRNA。同時螢火蟲雙熒光素酶的檢測體系中，也顯示了其具有很好的干擾效果(序列優(yōu)化后可達到177 pM IC50)。此外，這種納米顆粒體現(xiàn)了極好的血漿穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)有利于今后siRNA給藥方法研究以及RNA納米技術方面的研究。
　　針對siRNA藥物面臨的穩(wěn)定性差，存在脫靶效應，毒性和免疫反應，給藥體系構建困難這些主要問題，我們做出成功嘗試。5-硝基吲哚