α1-抗胰蛋白酶對體外循環(huán)術后急性肺損傷的保護作用研究.pdf

1、體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)技術自二十世紀五十年代成功用于臨床以來，已成為心內(nèi)直視手術的必備手段，隨著科學技術的進步，體外循環(huán)機器和相關管道材料的改良，術中心肌保護、灌注技術以及圍手術期監(jiān)護治療水平的進步，CPB手術的安全性大大提高，但是CPB帶來的非生理性的血流灌注仍可誘發(fā)全身性炎癥反應綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，導致術后各臟器

2、系統(tǒng)不同程度的損傷。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是SIRS的早中期改變，癥狀輕的患者僅為亞臨床表現(xiàn)，而重癥患者則表現(xiàn)為ALI，甚至是急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI/ARDS會顯著延長病人術后呼吸機應用時間、ICU滯留時間等，不但增加了家庭及社會負擔，而且增加患者的死亡率，嚴重影響預后。因此，研究CPB對肺的損傷機制以及探索行之有效

3、的肺保護方法，對CPB手術患者術后肺功能的恢復及遠期生存至關重要。
　　α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，僅1-AT）是一種具有蛋白酶抑制作用的急性時相反應蛋白，分子量為5.2kDa，是血漿中主要的蛋白酶抑制物，能抑制中性粒細胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、血漿素等蛋白酶的活性，可以保護機體內(nèi)的正常組織避免蛋白酶的損傷。最近的研究表明α1-AT可抑制炎癥反應過程中的多個環(huán)節(jié)，抑制炎癥介質(zhì)和細胞因子的過度釋放，減少PM

4、N的激活，清除超氧陰離子、自由基等活性氧，維持氧化/抗氧化物的動態(tài)平衡，避免過度應激對機體自身的損傷，繼而具有防治肺損傷的功效。本研究從炎癥因子的釋放、細胞凋亡、氧化-抗氧化角度探討α1-AT對CPB術后肺功能的保護作用。
　　第一部分 血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與急性肺損傷的相關性研究
　　目的:
　　急性肺損傷(ALI)是體外循環(huán)(CPB)心臟手術后常見的并發(fā)癥。本研究擬觀察CPB心臟直視手術圍術期內(nèi)血漿晚期氧化蛋白

5、產(chǎn)物(AOPPs)的水平變化，明確氧化應激與CPB術后ALI的相關性，以及AOPPs預測CPB術后ALI的有效性。
　　方法:
　　本研究為前瞻性研究，經(jīng)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會同意批準，將2014年1月1日至5月31日南方醫(yī)院胸心外科在CPB下行心臟手術的患者納入本研究。參考1994年歐美聯(lián)系會議制定的ALI診斷標準，根據(jù)患者CPB手術后是否發(fā)生ALI，將患者分為ALI組和非ALI組。在術前、術后1小時、術后12小時

6、、術后24小時和術后48小時獲得患者全血2ml。采用ELISA方法檢測血漿中AOPPs的濃度。研究所涉及的計量數(shù)據(jù)，均先通過one-sampleKolmogorov-smimov檢驗進行正態(tài)分布檢驗。Student's t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗檢測兩組之間各指標的差異。應用多因素逐步Logistic(stepwiselogistic)回歸模型分析AOPPs與ALI發(fā)生發(fā)展的相關性，以受試者工作特征曲線(ROC)及曲線下面積

7、(AUC)評價這個生物學指標的回歸模型對ALI的診斷價值。所有統(tǒng)計學分析采用SPSS22.0軟件進行分析，P＜0.05為有顯著性差異。
　　結果:
　　在本研究期間共有70例符合本研究納入標準的、在CPB下行心臟手術的成人患者，其中18人(25.7％)發(fā)生ALI。ALI組患者慢性阻塞性肺病、高血壓的患病率高于非ALI組。ALI組患者住院時間和重癥監(jiān)護時間較非ALI組患者明顯延長。CPB結束后，所有患者血漿中AOPPs的濃度較

8、術前明顯升高，并且在術后1小時開始升高，術后12小時開始下降。ALI組患者CPB術后1小時、12小時、24小時、48小時AOPPs濃度明顯高于非ALI組患者。非ALI組患者血漿AOPPs濃度在術后24小時降至基線水平，ALI組患者血漿AOPPs濃度在術后1小時達到峰值，術后12小時快速下降，在術后24小時再次升高。
　　結論:
　　本研究表明，CPB術后血漿中AOPPs的濃度明顯升高，其升高水平與肺損傷程度明顯相關。血漿中A

9、OPPs是CPB術ALI早期可靠的預測指標。AOPPs在CPB術后肺損傷的臨床表現(xiàn)和病情進展中的作用還需要進一步的研究。
　　第二部分 α1-抗胰蛋白酶對體外循環(huán)肺損傷保護作用的實驗研究
　　目的:
　　1、應用α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)對體外循環(huán)(CPB)術后急性肺損傷(ALI)比格犬進行干預，從氧化-抗氧化角度說明其對肺臟具有保護作用。
　　2、研究α1-AT對比格犬CPB術后肺部炎癥反應的抑制作用，并探

10、討其抑制炎癥的作用機制。
　　方法:
　　1、急性肺損傷模型的建立。選取成年健康比格犬30只(14.5±0.63)kg，隨機分為3組，Ⅰ組（空白對照組），Ⅱ組（CBP術后ALI組），Ⅲ組(CPB術后ALI+α1-AT干預組)。采用2％戊巴比妥鈉靜脈麻醉（劑量30mg/kg），CPB手術過程中用微量泵持續(xù)泵入維持麻醉效果（劑量10 mg/kg/h）。
　　2、給藥方法及監(jiān)測指標。Ⅲ組在預充液中加入50 mg/kg劑量的α

11、1-AT。分別記錄各組動物T1:CPB手術前，T2:CPB轉(zhuǎn)機后30分鐘，T3:CPB轉(zhuǎn)機后2小時，T4:CPB結束后6小時，T5:CPB結束后12小時的心率、血壓、氧飽和度等生命體征，在每個時間點留動脈血標本，用于實時監(jiān)測血氣分析及其他炎癥指標的檢測。
　　結果:
　　1、血氣分析與血流動力學監(jiān)測結果:CPB術后急性肺損傷組（對照組）氧合指數(shù)較空白對照組顯著降低(P＜0.001)，應用α1-AT干預（實驗組）可以明顯提高比

12、格犬氧合指數(shù)，改善組織氧合。PiCCO監(jiān)測結果也顯示應用α1-AT干預可以明顯降低EVLW、PVPI等血流動力學指標。
　　2、與空白對照組比較，對照組、實驗組比格犬CPB術后血漿IL-8，TNF-α，MMP-9濃度均明顯升高(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。與對照組比較，使用α1-AT預處理能顯著降低這些炎癥因子與蛋白酶的水平。
　　結論:
　　1、α1-AT可有效減輕比格犬CPB術后肺損傷，改善肺

13、功能和組織氧合、降低血管外肺水指數(shù)及毛細血管通透性指數(shù)，減輕肺水腫。
　　2、α1-AT能顯著減少比格犬CPB術后肺組織中炎癥因子及蛋白酶的表達，減輕炎癥反應。
　　3、α1-AT通過減少活性氧生成，抑制氧化應激對肺部的損害來實現(xiàn)其保護肺功能的作用。
　　第三部分 α1-抗胰蛋白酶對人肺泡上皮細胞氧化應激損傷的保護作用
　　目的:
　　本研究以體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞（HPAEpiC細胞）為研究對象，用H2

14、O2處理HPAEpiC細胞，建立細胞氧化應激損傷模型，觀察氧化應激下，HPAEpiC細胞的活性氧(ROS)生成、細胞存活率，F(xiàn)asL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、caspase-9、以及UCP-2的表達變化，以及預先給予α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)能否減少ROS生成、下調(diào)凋亡相關蛋白、提高細胞存活率。初步探討α1-AT對肺泡上皮細胞氧化應激損傷的保護作用。
　　方法:
　　實驗分為空白對

15、照組、對照組（H2O2處理組）和實驗組(H2O2處理與α1-AT(2mg/ml)干預組），以濃度為500μmol/L的H2O2處理HPAEpiC細胞24 h。采用激光共聚焦顯微鏡檢測HPAEpiC細胞線粒體ROS產(chǎn)生，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，采用AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)測定FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、ca

16、spase-9、以及UCP-2的表達變化。
　　結果:
　　1、與空白對照組比較，對照組的HPAEpiC細胞在H。O。的作用下凋亡率明顯升高(P＜0.05)，同時FasL、Fas、以及cleaved caspase-8表達顯著上調(diào)。實驗組加入α1-AT后，HPAEpiC細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)，F(xiàn)asL、Fas以及cleavedcaspase-8表達也相應下調(diào)。
　　2、與空白對照組比較，對照組的HPAEpi

17、C細胞caspase-3、caspase-9表達顯著上調(diào)，而UCP-2表達下降(P＜0.05)。實驗組加入α1-AT后，HPAEpiC細胞caspase-3、caspase-9表達也相應下調(diào)，而UCP-2表達上調(diào)(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、氧化應激可以激活外源性凋亡通路，上調(diào)Fas、FasL、cleaved caspase-8表達，導致HPAEpiC細胞凋亡。
　　2、氧化應激可以激活內(nèi)源性凋亡通路，上調(diào)c