人胰島素原基因的設(shè)計(jì)克隆及在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、目前世界上近兩億名患者用胰島素進(jìn)行治療(發(fā)展中國(guó)家患者的數(shù)量還在逐漸增加)，治療上的進(jìn)步使糖尿病患者壽命延長(zhǎng)。胰島素一般是從豬、牛胰中提取、由于其分子結(jié)構(gòu)與人胰島素存在差異，而且在動(dòng)物內(nèi)臟中胰蛋白酶比較活躍，因此胰島素在提取時(shí)很容易被蛋白酶降解而失活，得率不高。隨著糖尿病的發(fā)病率的升高，胰島素制劑的需用量將相應(yīng)增加，可能會(huì)引起供應(yīng)的嚴(yán)重不足，這種情況促使人們產(chǎn)生了不以動(dòng)物胰腺為原料，盡可能開(kāi)發(fā)人胰島素制劑的要求?；蚬こ毯铣扇艘葝u素則成

2、為當(dāng)今世界醫(yī)藥生產(chǎn)的首選。
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)并分子克隆適宜于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的人胰島素原基因。以美國(guó)國(guó)家基因庫(kù)(GenBank)發(fā)布的人胰島素原的氨基酸序列為模板，參考大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性以及所用表達(dá)載體(pGEX-3x)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)人胰島素原基因?yàn)?個(gè)寡核苷酸片段，為使表達(dá)純化方便插入EcoRI及BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，利用分步PCR步驟及重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術(shù)，休外延伸獲得完整的人胰島素原基因(H

3、ins)。T-A克降后，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒鑒定并測(cè)序。測(cè)序正確的人胰島素原(Hins)基因插入E.coli高效表達(dá)載體pGEX-3X中進(jìn)行了融合表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)使用重疊延伸PCR(SOEPCR)技術(shù)，結(jié)合Klenow片段處理，體外延伸獲得完整的具有大腸桿菌偏好的人胰島素原基因Hins(B鏈-C肽-A鏈)。
　　 (2)Hins基因片段通過(guò)粘性末端克隆到pMD19-T載體上。質(zhì)粒鑒定測(cè)序結(jié)果，經(jīng)過(guò)NC

4、BIBlast對(duì)比，與AAP33446.1(homo sapiens insul in)的蛋白質(zhì)序列的相似度為100％，與NM000207.2(homo insul in mRNA)核苷酸序列相似度為86％。
　　 (3)成功構(gòu)建pGEX-3X表達(dá)體系，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出融合蛋白。蛋白電泳結(jié)果顯示：含有空載體的大腸桿菌蛋白中，儀在26KD處有GST蛋白的表達(dá)，而含有Hins基因的融合蛋白在蛋白分子量32KD處有特異的蛋白質(zhì)

5、條帶。
　　 (4)優(yōu)化表達(dá)體系：誘導(dǎo)時(shí)間6h、IPTG終濃度1.0mmol/L、培育溫度30℃時(shí)，含有轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞表達(dá)量最高。
　　 結(jié)論：在Taq DNA聚合酶延伸反應(yīng)前以Klenow片段處理，可提高較短覆蓋末端或較低專(zhuān)一性末端正確延伸的成功率。利用SOEPCR與Klenow片段預(yù)處理結(jié)合的方法，克隆出完整的具有大腸桿菌偏好的人胰島素原基因Hins，并建立原核表達(dá)體系，成功在大腸桿菌中表達(dá)含人胰島素原基因的融合蛋白。