以枯草芽孢桿菌遞呈對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28對(duì)凡納對(duì)蝦抗病毒免疫保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV)傳染性強(qiáng)、宿主范圍廣、致死率高，是我國(guó)及世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生爆發(fā)性流行病的主要病原，嚴(yán)重制約著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本課題組前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)WSSV囊膜蛋白-VP28的重組工程菌(B.subtilis-VP28)，并研究發(fā)現(xiàn)了該菌株能顯著提高攻毒后的中國(guó)對(duì)蝦和螯蝦存活率并且能特異性保護(hù)機(jī)體抗WSSV感染，但此免疫保護(hù)機(jī)制還不甚清楚。本課題在此基礎(chǔ)上，通過(guò)口服

2、重組菌株B.subtilis-VP28免疫凡納對(duì)蝦，研究B.subtilis-VP28對(duì)凡納對(duì)蝦抗WSSV感染的保護(hù)效果及免疫功能的影響，并克隆分析與對(duì)蝦適應(yīng)性免疫相關(guān)的免疫球蛋白超家族分子Dscam可變區(qū)序列，從Dscam識(shí)別與細(xì)胞吞噬途徑探討重組菌B.subtilis-VP28誘導(dǎo)對(duì)蝦特異性抗病毒感染的分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.重組菌株B.subtilis-VP28對(duì)凡納對(duì)蝦體液免疫因子的影響
　　

3、 以芽孢重組菌B.subtilis-VP28作為免疫原口服免疫凡納對(duì)蝦，并以B.subtilis和正常健康對(duì)蝦作為對(duì)照，進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，并取對(duì)蝦血清檢測(cè)抗菌活力、溶菌活力、酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性和堿性磷酸酶(AKP)活性，另外取對(duì)蝦血細(xì)胞抽提總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)Toll樣受體、溶菌酶、血藍(lán)蛋白和Dscam基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B.subtilis-VP28能

4、顯著提高凡納對(duì)蝦血清各免疫因子的活性，說(shuō)明B.subtilis-VP28對(duì)凡納對(duì)蝦機(jī)體的體液免疫功能具有顯著的增強(qiáng)作用。此外，B.subtilis-VP28還能顯著提高Toll樣受體、溶菌酶、血藍(lán)蛋白和Dscam基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，揭示B.subtilis-VP28能夠介導(dǎo)凡納對(duì)蝦機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)并釋放免疫因子。
　　 2.重組菌株B.subtilis-VP28對(duì)凡納對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞特異性吞噬的影響
　　 將重組菌

5、株B.subtilis-VP28的芽孢形式和海藻多糖口服投喂免疫凡納對(duì)蝦28d，并以B.subtilis和正常健康組作對(duì)照，分別在免疫4d、7d、14d、28d后，檢測(cè)不同試驗(yàn)組凡納對(duì)蝦血細(xì)胞吞噬活性。另外分別在免疫4d、14d、28d后，差異分析各試驗(yàn)組血細(xì)胞對(duì)不同抗原（WSSV和弧菌）的吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在免疫不同時(shí)間內(nèi)，B.subtilis-VP28均能顯著提高凡納對(duì)蝦血細(xì)胞吞噬WSSV功能，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。此外，

6、在不同免疫時(shí)間內(nèi)，B.subtilis-VP28能顯著提高血細(xì)胞對(duì)WSSV的吞噬（與其對(duì)弧菌的吞噬能力相比）;而B(niǎo).subtilis組和海藻多糖組的對(duì)蝦血細(xì)胞對(duì)吞噬WSSV和弧菌不存在顯著性差異。說(shuō)明B.subtilis-VP28具有誘導(dǎo)凡納對(duì)蝦血細(xì)胞特異性吞噬WSSV的作用，揭示B.subtilis-VP28可通過(guò)引發(fā)凡納對(duì)蝦血細(xì)胞特異性吞噬作用介導(dǎo)機(jī)體的特異性抗病毒感染。
　　 3.凡納對(duì)蝦Dscam選擇性剪接外顯子位點(diǎn)鑒別

7、及可變區(qū)序列分析
　　 根據(jù)Genbank公布的凡納對(duì)蝦Dscam(LvDscam)的cDNA序列，分別以該基因的免疫球蛋白區(qū)和粘連蛋白區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序后，由多重序列比對(duì)得知:LvDscam存在3個(gè)選擇性剪接外顯子，分別位于Ig2-N（126-177aa）、Ig3-N(228-268aa)和整個(gè)Ig7區(qū)(603-698aa)。正常情況下LvDscam可通過(guò)RNA選擇性剪接機(jī)制產(chǎn)生3個(gè)Ig2-N區(qū)變

8、構(gòu)體、4個(gè)Ig3-N區(qū)變構(gòu)體和2個(gè)Ig7區(qū)變構(gòu)體，說(shuō)明LvDscam具有分子多樣性。另外，由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知:LvDscam在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的無(wú)脊椎動(dòng)物分枝上占據(jù)一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化亞單位分枝，預(yù)示著LvDscam可能是一種新型的無(wú)脊椎動(dòng)物Dscam蛋白。
　　 4.差異分析不同免疫原刺激凡納對(duì)蝦Dscam特異性變構(gòu)體庫(kù)的特征
　　 口服重組菌株B.subtilis-VP28和海藻多糖免疫凡納對(duì)蝦28d，并以B.subtilis

9、和正常健康組作對(duì)照，根據(jù)LvDscam可變區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆LvDscam可變區(qū)片段，并隨機(jī)選取15個(gè)克隆子送至測(cè)序。由多重序列比對(duì)得知:B.subtilis-VP28、B.subtilis、海藻多糖共引發(fā)LvDscam產(chǎn)生13個(gè)Ig2-N區(qū)變構(gòu)體，15個(gè)Ig3-N區(qū)變構(gòu)體和11個(gè)Ig7區(qū)變構(gòu)體，預(yù)測(cè)可編碼2145(13×15×11=2145)種LvDscam選擇性剪接變構(gòu)體，由此可說(shuō)明LvDscam具有豐富的分子多樣性。通過(guò)組