幾種淡水魚過(guò)敏原小清蛋白的純化鑒定及性質(zhì)研究.pdf

1、魚類產(chǎn)品因?yàn)槠湄S富的蛋白質(zhì)和脂肪酸而成為人們喜愛(ài)的食物，然而魚類中的過(guò)敏原也成為威脅人類健康的一個(gè)重要來(lái)源。研究證明，淡水魚的主要過(guò)敏原是小清蛋白，因而小清蛋白的研究尤為重要。
　　本研究以幾種淡水鯉科魚類肌肉為原材料，建立一種快速純化小清蛋白的方法，即煮沸，兩次三氯乙酸（TCA）沉淀進(jìn)行初步純化。煮沸可以去除大部分雜蛋白，兩次 TCA沉淀后小清蛋白大量富集，只有一條雜蛋白條帶。用Sephacryl S-200 HR丙烯酰胺葡聚糖

2、凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，得到了高純度（>90％）的淡水魚小清蛋白。由于高純度小清蛋白在紫外掃描時(shí)有特征吸收峰，本實(shí)驗(yàn)中吸收值圖譜顯示純化的蛋白在200nm-350nm有特征吸收峰，證明了純化出的蛋白是高純度的小清蛋白。并用飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析得到了純化蛋白的進(jìn)一步生物學(xué)信息。
　　本實(shí)驗(yàn)使用能夠生產(chǎn)小清蛋白EG8單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞來(lái)制備小清蛋白單克隆抗體。將雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠制備腹水，分離純化后得到的小清蛋白單克隆抗體效價(jià)≥8

3、0000，并且特異性良好。將純化的小清蛋白單克隆抗體進(jìn)行電泳和免疫印跡分析，結(jié)果顯示生產(chǎn)的單克隆抗體純度較高。
　　采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA和免疫印跡研究了鯉魚小清蛋白和鯽魚，鰱魚，草魚粗提蛋白之間的免疫交叉反應(yīng)。免疫印跡結(jié)果說(shuō)明確實(shí)有交叉反應(yīng)發(fā)生，反應(yīng)的分子量在12KDa左右。進(jìn)一步使用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA曲線計(jì)算交叉反應(yīng)率，最后發(fā)現(xiàn)鯉魚小清蛋白和草魚，鯽魚，鰱魚粗提蛋白之間的交叉反應(yīng)率分別為83.34%，96.35%，60.93%

4、。
　　最后本文對(duì)純化的鯉魚和鰱魚小清蛋白進(jìn)行體外模擬胃腸液分析。在胃蛋白酶作用下，鯉魚和鰱魚小清蛋白都發(fā)生快速降解，降解條帶的分子量較小，但鰱魚降解速度比鯉魚慢，而在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，鯉魚和鰱魚小清蛋白都比較穩(wěn)定。進(jìn)一步用抑制性ELISA來(lái)分析鯉魚，鰱魚小清蛋白的胃腸液消化產(chǎn)物致敏性的變化，結(jié)果顯示，鯉魚,鰱魚小清蛋白在和胃蛋白酶反應(yīng)1h后，其消化產(chǎn)物的致敏性有比較大的降低，隨著消化產(chǎn)物濃度的稀釋，致敏性也隨之降低