新型低毒性兩親性殼聚糖衍生物的合成及其蛇床子素膠束的研制.pdf

1、目的:合成新型的兩親性殼聚糖衍生物，希望具有較好的安全性和生物相容性，并以其為載體，以疏水性的抗腫瘤藥物蛇床子素（Osthole，OST）為模型藥物，制備OST載藥膠束，通過膠束疏水層包載藥物，增加藥物溶解性，通過膠束親水外層促進藥物吸收和被動靶向，從而改變OST溶解性差、吸收差、分布廣的缺點，增加藥物的抗腫瘤效果。
　　方法:(1)通過烷基化反應，在殼聚糖的自由氨基上連接上三個甲基，得到親水性的N-三甲基殼聚糖（N-trimet

2、hyl chitosan，TMC），再在游離的氨基上繼續(xù)引入長鏈軟脂?；蚬秕；铣尚滦偷膬捎H性殼聚糖衍生物，N-癸酰基-N-三甲基殼聚糖（N-caprinoyl-N-trimethyl chitosan, CA-TMC）和N-軟脂?；?N-三甲基殼聚糖（N-palmityl-N-trimethyl chitosan, PA-TMC）。經(jīng)紅外光譜、1H-NMR驗證新型聚合物的結構，并通過元素分析法定量分析引入基團的接枝率。采用芘熒光探

3、針法測定聚合物的臨界膠束濃度。通過細胞毒性實驗、溶血性實驗和急性毒性實驗考查載體的生物相容性評價其安全性。(2)以兩親性殼聚糖聚合物為載體，采用不同的制備方法制備OST載藥膠束，以包封率、粒徑和穩(wěn)定性、后續(xù)實驗等因素選取制備方法，再以單因素和正交設計等方法優(yōu)化載藥膠束的處方工藝。利用激光粒徑動態(tài)分析儀、高分辨率投射電鏡、原子力顯微鏡進行表征，并考察不同pH值介質(zhì)中載藥膠體的釋放特性。(3)以OST原料藥，采用MTT法篩選敏感的腫瘤細胞，

4、評價OST及其載藥膠束的細胞毒性，同時采用流式細胞術探索藥物的作用機制。采用共聚焦顯微鏡和原子力顯微鏡觀察藥膠束的細胞靶向性和吸收過程。
　　結果:(1)合成了2種新型的殼聚糖衍生物，其結構得到紅外圖譜和1HNMR譜的表征；元素分析法顯示隨著三甲基殼聚糖季胺化程度的升高，疏水基的接枝率降低。聚合物的臨界膠束濃度在0.0016～0.088 mg×mL-1，提示載藥膠束有較好的抗稀釋能力。細胞毒性實驗表明載體對A549、Hela和HL

5、7702細胞的抑制作用有隨著載體濃度升高而升高的趨勢，但總體抑制率較低，具有較好細胞相容性。溶血實驗表明載體的溶血性遠低于常用靜脈注射的低分子表面活性劑Tween80而與F188相當，說明聚合物具在考察濃度范圍內(nèi)，血液相溶性好。CA-TMC的半數(shù)致死量（Lethal Dose50，LD50）值為368.79 mg×kg-1，PA-TMC的LD50為405.31 mg×kg-1，具有較大的LD50；與生理鹽水組相比，給藥組小鼠心肝脾肺腎沒

6、有顯著性差異，說明聚合物載體具有良好的組織相容性。安全性實驗表明新型的兩親性殼聚糖衍生物具有較好的生物相容性和安全性。（2）綜合分析考慮選擇超聲法作為載藥膠束的制備方法，通過單因素實驗，正交實驗優(yōu)化OST/PA-TMC和OST/CA-TMC載藥膠束制備方法。再此基礎上進一步確定最佳制備方法為載體濃度1.0 mg·mL-1，載藥比25%，超聲次數(shù)200次。將不同的載體按此方法制備的載藥膠束使OST在水中的溶解性均有明顯提高。綜合各載體評分

7、，最終選取最佳載體CA-TMC2進一步表征。OST/CA-TMC2載藥膠束平均粒徑((183.6±26.1) nm，PDI為0.079，包封率(79.29±0.76)%，載藥量(20.01±0.07)%。透射電鏡和原子力顯微鏡照片顯示，制得的載藥膠束近球狀，形態(tài)比較圓整，粒徑在180 nm左右。OST/CA-TMC2載藥膠束在pH5.0和pH7.4的釋放介質(zhì)中，釋放行為符合Higuchi方程。（3）實驗表明OST對乳腺癌細胞株MCF-7

8、和宮頸癌細胞株Hela細胞較為敏感，半數(shù)抑制率（half Inhibitory of the substance Concentration，IC50）分別為55.20μg×mL-1、60.79μg×mL-1。將OST制備成OST/CA-TMC2載藥膠束后，藥物的濃度效應范圍更大，能顯著提高抗腫瘤活性。與OST相比OST/CA-TMC2載藥膠束對Hela更具親和性，抑制作用更顯著。同時，OST/CA-TMC2載藥膠束沒有改變藥物致MCF

9、-7和Hela細胞死亡的途徑，還有明顯的促進作用。原子力顯微鏡實驗表明，細胞給藥物后，細胞表面褶皺增加明顯，說明吞噬作用正在進行，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)褶皺增加的范圍恰為1-2個膠束粒子粒徑，說明吞噬作用是藥物進入細胞的一種方式。共聚焦顯微鏡實驗顯示了OST/CA-TMC2載藥膠束能快速進入細胞，并最終定位于細胞核，且Hela細胞核內(nèi)的熒光更為明顯，這一現(xiàn)象從一個側面解釋了原料藥對MCF-7作用略強，而載藥膠束對Hela細胞作用略好。