葡萄糖氧化酶的表達(dá)及其在半纖維素酶解方面的應(yīng)用.pdf

1、木糖是一種單糖，它可以由半纖維素酶解得到。由于木糖不會(huì)導(dǎo)致糖尿病和肥胖等疾病的發(fā)生，它常常被用于作為蔗糖的替代品。過(guò)氧化氫(H2O2)預(yù)處理蔗渣可以促進(jìn)分餾、溶解、水解和分離纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。而β-D-葡萄糖氧化酶（GOD）可以催化葡萄糖的氧化和氧氣的還原并生成過(guò)氧化氫。因此，GOD也許能夠取代H2O2的作用達(dá)到提高半纖維素水解效率的目的。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們?cè)O(shè)計(jì)一系列的實(shí)驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　本研究中，為了提高GO

2、D的表達(dá)量以及為后續(xù)的深入研究打下一定基礎(chǔ)，我們構(gòu)建并獲得了兩個(gè)單基因重組表達(dá)酵母。首先，黑曲霉CICC40179的GOD基因被克隆進(jìn)載體pMD19-T。用BLAST進(jìn)行序列分析表明這是一段新的未被報(bào)道過(guò)的GOD基因。3D結(jié)構(gòu)模擬（DS2.5，Accelrys Software Inc.，San Diego，CA）比較了這個(gè)新的GOD蛋白和另一同源蛋白（Protein Data Bank登錄號(hào)：No.1CF3_A），結(jié)果顯示兩個(gè)突變的氨

3、基酸殘基位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的外側(cè)部分，突變并沒(méi)有改變其蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)。將這段基因序列分別通過(guò)載體 p2μRCMB和pGAPZαA導(dǎo)入釀酒酵母AS2.489和畢赤酵母X33中進(jìn)行表達(dá)。重組釀酒酵母表達(dá)的GOD蛋白分子量約為100 kDa，而重組畢赤酵母的GOD蛋白分子量則約為70 kDa，且重組畢赤酵母的GOD酶活顯著高于重組釀酒酵母。選用重組畢赤酵母進(jìn)行后續(xù)酶學(xué)特性、酶法水解等研究。GOD的最適 pH和溫度分別為7.5和35℃，在25℃、

4、30℃、35℃和40℃各培養(yǎng)2 h，酶活力幾乎沒(méi)有發(fā)生改變。因此，這個(gè)新的GOD可能是一種中溫酶并且具有較為寬廣的工作溫度。金屬離子Mn2+和Co2+能顯著提高GOD的活性，然而Zn2+則顯著的抑制酶活。對(duì)該重組畢赤酵母進(jìn)行培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化，使得GOD的活性從4.9 U/mL（搖瓶酶活）提升至16.31 U/mL（SL-05發(fā)酵罐酶活）。
　　由于GOD的催化特性，本研究嘗試將其應(yīng)用于半纖維素酶解生產(chǎn)木糖的工藝過(guò)程。通過(guò)使用Bo