米黑根毛霉脂肪酶密碼子優(yōu)化及其在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、脂肪酶作為生物催化劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和生物柴油等領(lǐng)域。米黑根毛霉脂肪酶(RML)是一條α/β型單鏈多肽，具有較好的立體選擇性、較高的水解和轉(zhuǎn)酯活力。由于天然米黑根毛霉脂肪酶產(chǎn)量低，無法滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求。本研究利用基因工程技術(shù)將米黑根毛霉脂肪酶基因整合到畢赤酵母實(shí)現(xiàn)異源高效表達(dá)，提高了米黑根毛霉脂肪酶產(chǎn)量，對(duì)該酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的RML全長基因?yàn)槌霭l(fā)材料，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，優(yōu)化了RML基因密

2、碼子，并以此構(gòu)建了以FLD1為啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)畢赤酵母基因工程菌。運(yùn)用搖瓶發(fā)酵篩選，并初步研究了異源表達(dá)的米黑根毛霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)。主要的研究內(nèi)容及結(jié)果摘要如下。
　　1.優(yōu)化了RML基因。以實(shí)驗(yàn)室保存的米黑根毛霉脂肪酶基因?yàn)槌霭l(fā)材料，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，利用重疊延伸PCR定點(diǎn)突變優(yōu)化了RML基因中7個(gè)低頻密碼子，并以優(yōu)化前后含前肽的RML基因分別構(gòu)建畢赤酵母誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pFLD-RMLori和pFLD-RMLop

3、t。
　　2.構(gòu)建了RML高效基因工程菌。將pFLD-RMLori和pFLD-RMLopt載體分別電轉(zhuǎn)化入GS115中，通過三丁酸甘油酯酶活力檢測平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，分別獲得酶活力最高的兩株菌GS115/pFLD-RMLori32＃和GS115/pFLD-RMLopt42＃，其酶活力分別達(dá)到120U/ml和195U/mL。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，RML酶活力提高了60％。
　　3.初步研究了異源表達(dá)的RML酶學(xué)性質(zhì)。以GS115

4、/pFLD-RMLopt42?？寺∽訐u瓶發(fā)酵上清液為對(duì)象，利用對(duì)硝基苯酚酯(pNP)對(duì)重組RML進(jìn)行了初步的酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明，RML的最適反應(yīng)溫度和pH分別為45℃和pH8.0。40-60℃溫育2h后，酶活力只殘留約15％，K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+等對(duì)RML酶活有輕微抑制作用，F(xiàn)e3+、Zn2+、Fe2+則對(duì)其有較強(qiáng)抑制作用，而Sr2+對(duì)RML有一定激活作用；其最適水解底物為對(duì)硝基苯酚丁酸酯(C4)。