基于csaB基因和質粒組的蠟狀芽胞桿菌群的分型以及進化.pdf

1、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)群包括產(chǎn)炭疽毒素的炭疽芽胞桿菌(B.anthracis)，機會致病菌蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)，產(chǎn)殺蟲晶體蛋白并且被廣泛用于生物防治的蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)，以及其它幾種芽胞桿菌。正是由于其中一部分菌株對人類健康構成威脅，而另一部菌株則可以用于生物農藥的開發(fā)，而且這個群的菌株廣泛存在于自然界的各個生境，對于菌株之間的區(qū)分一直以來受到研究者的重視。由于已經(jīng)報道的針

2、對于B.cereus群的鑒定分型方法分辨率不夠，很多不同的菌株不能有效地相互區(qū)分。對于B.thuringiensis菌株而言，由于挖掘更多的具有應用價值的活性物質需要分離鑒定到更多的新型菌株，而傳統(tǒng)的使用H-血清型鑒定的方法已經(jīng)停止使用，所以急需建立新型有效的鑒定方法。大規(guī)模的基因組測序數(shù)據(jù)的公開，為研究新型的用于區(qū)分的新型基因提供基礎。本研究著眼于尋找新型的基于核苷酸序列的菌株分型方法，并且研究分型結果所反映的生態(tài)與進化的規(guī)律，為B.

3、cereus群菌株大規(guī)模的鑒別以及進化研究提供理論基礎。同時考察新型分型系統(tǒng)對于B.thuringiensis菌株的鑒定的有效性。
　　由于水平基因轉移是細菌基因組的主要驅動力，而質粒是這個過程中的主要媒介，因此對于質粒的起源、進化、動態(tài)以及與染色體的具體關系的研究對于解釋微生物基因組的進化規(guī)律至關重要。B.cereus群不同的菌株含不同數(shù)量、不同種類以及不同大小質粒，有些菌株甚至含有超過10個大小從2kb到600kb的質粒，而且

4、本實驗室以前的研究顯示，在同一個菌株中，質粒上遺傳物質的生物量甚至大于染色體上的。因此，研究丑cereus群質粒的進化以及與染色體之間的關系可以為我們認識質粒在細菌進化中的作用與地位提供幫助。同時，到目前為止，超過100個來自B.cereus群的質粒的基因組序列被公開，為系統(tǒng)性地研究質粒的進化與動態(tài)提供基礎。本研究著重研究普遍存在于B.cereus中的大于100kb的質粒的進化，以及把整個B.cereus群質粒作為一個整體，研究其與染色

5、體之間的關系，在細菌種群水平揭示質粒的起源于動態(tài)以及對于種群形成和穩(wěn)定的作用。
　　通過分析大量的B.cereus群菌株的基因組，我們發(fā)現(xiàn)其中含有大量的具有潛在生物活性物質的基因。其中，細菌素的合成基因簇是非常豐富的一類。細菌素是一類對于與產(chǎn)生菌近緣的細菌有活性的抗微生物物質，其化學本質是由核糖體合成的多肽或者蛋白質類物質。其在醫(yī)學中的潛在應用以及在微生物生態(tài)中重要作用，使其越來越受重視。由于芽胞桿菌同時也是人類微生物組中的主要成

6、員，本研究通過研究人類不同身體位點微生物組中細菌素的多樣性以及分布規(guī)律，結合各個微生物組的細菌群落組成，嘗試揭示細菌素在人類微生物組的動態(tài)平衡中的重要作用。
　　1)使用csaB基因對B.cereus群菌株進行分型能夠反映其宿主類型
　　目前很多標志基因被用來鑒定和區(qū)分蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)群不同的菌株，但是大部分的標志基因序列變異性較低，區(qū)分效果不理想。本研究報道一個S-層蛋白錨定相關基因csaB來區(qū)分B.cer

7、eus群菌株以及評估其在蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)菌株鑒定與區(qū)分中的作用。
　　首先，csaB的系統(tǒng)發(fā)育樹與已報道的標志基因的系統(tǒng)發(fā)育樹具有相似但不相同的拓撲結構，而序列具有更大的變異性，不同菌株之間的一致性在78％～100％，而其它已經(jīng)報道過的標志基因，不同菌株之間的一致性一般都在85％以上。我們測序獲得76株B.thuringiensis菌株的csaB基因，結合從Genbank獲得122株B.cereus

8、群菌株獲得的序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。所有被分析的群菌株主要被聚集到兩個大的類群。其中，所有的B.anthracis菌株具有相同的csaB基因，可以與其它的菌株區(qū)分開，而B.cereus和B.thuringiensis菌株則不能被相互區(qū)分開，來自這兩個種的菌株離散地分布于兩個類群中。
　　基于兩個大類，超過80％分離自高等動物的菌株集中在Ⅰ類，22株分離自昆蟲的菌株中，20株集中在Ⅱ類，而分離自土壤的在兩個大類中均勻分布。并且一些有助

9、于細菌粘著以及編碼與高等動物相互作用的表面蛋白的基因，SLH蛋白基因的數(shù)目，Ⅰ類菌株的基因組中顯著性(p＜2.2e-16，Mann-Whitneytest)地高于Ⅱ類菌株的基因組中。我們推測兩個大類可能反映出B.cereus群的兩種不同的動物宿主，即高等動物和昆蟲。
　　2)使用csaB基因能夠對B.thuringiensis菌株進行有效的區(qū)分
　　我們分析了來自70個血清型的109個B.thuringiens菌株，發(fā)現(xiàn)它們

10、共享44個基因型，其中22個代表一個血清型，而19個代表兩個或者更多個血清型。同時，我們發(fā)現(xiàn)，同一血清型的不同亞型可以明顯地被分開，而同一血清亞型或者血清型（沒有亞型）的菌株被聚集在一起。結合已報道的鞭毛蛋白序列，所有的血清型以及亞型都可以被明顯地區(qū)分開。
　　總之，基于csaB基因的分型既可以對B.cereus群的菌株進行更精細的識別，同時可以反映B.cereus群祖先的兩種不同動物宿主類型，也可以作為一種對B.thuringi

11、ensis菌株進行鑒定區(qū)分的技術。
　　3)B.cereus群中大于100kb的質粒起源于由較小的質粒融合事件
　　大部分B.cereus群菌株富含豐富的質粒，有的甚至超過10個。同一菌株中，不同質粒的大小各不相同，最大的可以到600kb，最小的只有2kb。目前B.cereus群的質粒都是零散地被研究，大部分質粒只被報道了序列或者復制方式，對于系統(tǒng)地把整個B.cereus群的質粒當成一個整體來研究的沒有報道。作為水平基因轉移

12、中非常重要的載體，質粒在細菌基因組進化過程中起著至關重要的作用。許多細菌菌株含有多個質粒，但是這些質粒的起源，進化和動態(tài)變化規(guī)律，以及質粒和染色體之間的關系并不清楚。本文中對這些話題的研究主要通過關注來自B.cereus群的質粒。
　　我們首先通過研究質粒的最小復制子探討了31個大于100kb的質粒的起源，進化與動態(tài)規(guī)律。這些質粒上的65個潛在的最小復制子可以根據(jù)復制相關蛋白基因以及可能的復制起點分為6個大的類型。31個大質粒中的

13、29個含有兩個及其以上的最小復制子?；趶椭葡嚓P蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示位于同一質粒上的不同的最小復制子具有不同的進化歷史。因此，我們推測這些大質粒起源于較小的質粒的融合事件。由于存在于同一菌株中的質粒必須相容，而且B.cereus群中共存于同一菌株中的不同大質粒的最小復制子屬于不同的組或者亞組，因此，最小復制子的不同亞組可能決定著不同的不相容組性。
　　更為廣泛地分析1285個具有可預測的最小復制子的細菌質粒顯示，34％(443

14、)的質粒具有兩個或者兩個以上的最小復制子，并且這些質粒的基因組大小顯著性地大于具有一個最小復制子的質粒。因此，我們推測，由質粒融合事件形成較大質粒的現(xiàn)象在質粒的進化過程中普遍存在。
　　4)B.cereus群中的質粒是其染色體基因冗余的載體
　　我們收集到104個已知序列的B.cereus群質粒，通過關注質粒和染色體之間的共有基因(sharedgenes)來探究質粒和染色體之間的關系。一些基本特征，例如堿基組成(baseco

15、mposition)和密碼子選擇(codonusage)分析顯示位于質粒上的基因更接近于染色體上的可變基因，而非染色體的核心基因。盡管所有的染色體基因的COG功能類別在質粒的基因中均有代表，但是其比例差異明顯。當關注共有基因在質粒和染色體上的分布時，我們發(fā)現(xiàn)它們均勻分布。但是，相同的共有基因在染色體和質粒上具有不同的啟動子和（或）終止子序列，因此在轉錄水平上受不同的元件調控。我們推測為適應多變的環(huán)境，適應性相關的基因可以同時存在于質粒和

16、染色體上，為保證這種冗余只存在于基因水平，這些共有基因通常受不同的調控元件控制。
　　5)人類微生物組中細菌素基因的多樣性
　　大量B.cereus群菌株基因組序列被公開，使得通過基因組學的方法全面挖掘其與其它微生物以及宿主之間相互作用因子成為可能。我們預測到大量的具有潛在生物活性的物質，包括蛋白酶、抗生素以及細菌素。基于我們的預測，多個課題小組開展了相關的實驗驗證工作，部分成果已經(jīng)公開發(fā)表。本文重點關注細菌素。細菌素通常對

17、于產(chǎn)生菌近緣的細菌具有毒殺作用，因此它們在微生物群落生態(tài)中作用非常重要。人類不同的身體位點是不同微生物群落的天然棲息地，不同的位點具有不同的微生物圈，每個微生物圈中，細菌群落組成往往保持動態(tài)平衡。然而影響這些平衡的因子到目前為止還不十分清楚。
　　我們通過尋找已經(jīng)報道的細菌素的相似蛋白序列，在人類微生物組的宏基因組數(shù)據(jù)中尋找可能的細菌素序列，一共預測到802個Ⅰ類細菌素，3048個Ⅱ類細菌素。一方面，不同的位點具有不同豐度的細菌素

18、，而豐度最高的樣品則來自于口腔，事實上大部分細菌素來自口腔樣品。蛋白質相似性網(wǎng)絡分析顯示來自同一位點的細菌素聚集在一起，并且每個位點中，少數(shù)幾個細菌素占主導。當我們關注預測到細菌素的參照基因組時，對于來自口腔樣品中的細菌素，絕大部分大部分來自口腔優(yōu)勢菌葡萄球菌(Streptococcus)。對于其它位點，情況類似，細菌素所對應的參照基因組主要來自各位點的優(yōu)勢菌群。我們認為細菌素在形成與維持各個位點的微生物群落過程中起主要作用。另一方面，