非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶的結構與功能研究.pdf

1、非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶Tn-gly為(β/a)<,8>桶狀結構,具有水解功能和轉糖苷功能的耐熱單體酶.該酶可作為一個很好的模型來研究糖苷酶的反應機制,底物特異性和耐熱的分子基礎.根據對該酶的晶體結構解析和同家族酶的結構比較,推測Glu164和Glu338分別是質子供體和親核基團兩個活性位點;在a-螺旋N端第一位的脯氨酸和蛋白質外周的精氨酸是耐熱機制的關鍵位點和關鍵氨基酸殘基.該論文為了鑒定這些氨基酸殘基的功能,通過基因定點

2、突變的方法分別把Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344和Arg325置換成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu,同時還對Pro316和Pro356進行了雙置換.各個突變基因均得到表達,突變酶經過純化得到電泳純;用CD光譜進行了野生酶和突變酶的結構比較.通過突變酶的酶功能和酶學性質分析,結果表明Glu164和Glu338分別β-糖苷酶Tn-gly水解反應時地質子供體和親核基團,親核基團的突變酶Tn-

3、glyE338A可以合成混合型糖苷鍵寡糖類似物;脯氨酸的剛性結構在a-螺旋N端第一位和精氨酸在蛋白質外周形成離子鍵是耐熱機制的關鍵位點和關鍵氨基酸殘基.另外,通過同家族酶與自然底物、合成底物或抑制劑共結晶的結構分析和同源性比對,初步推測非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶的Gln18和Glu392與酶既有葡萄糖苷酶活性又有半乳糖苷酶活性有關,Asn282和Tyr284與酶的甘露糖苷活性有關,Trp385的疏水吲哚側連對底物在酶活性中心的