殺念菌素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶的研究.pdf

1、殺念菌素是由鏈霉菌FR-008(Streptomyces sp. FR-008)所產(chǎn)生的具有廣譜抗真菌活性的多烯類(lèi)抗生素。該類(lèi)化合物主要來(lái)自細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)這類(lèi)化合物是通過(guò)與真菌細(xì)胞膜內(nèi)的甾醇分子相互作用形成通透性孔道來(lái)發(fā)揮抗真菌活性的。由于多烯類(lèi)抗生素的廣譜抗菌活性以及耐藥性產(chǎn)生幾率小使得它們?cè)谂R床上的應(yīng)用已經(jīng)超過(guò)半個(gè)世紀(jì),成為治療許多危重深部真菌感染的重要藥物。多烯類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)中普遍存在一個(gè)特殊的氨基海藻糖,它不僅在

2、該類(lèi)抗生素發(fā)揮抗真菌活性中起到了重要作用,同時(shí)也影響了該類(lèi)化合物的水溶性等理化性質(zhì)。鑒于氨基海藻糖的重要性,長(zhǎng)期以來(lái)科學(xué)家們對(duì)負(fù)責(zé)其加載的糖基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出了濃厚的研究興趣,但多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶體外表達(dá)的困難使得對(duì)它的底物特異性以及影響酶催化活性的重要氨基酸殘基等方面的研究難以順利展開(kāi)。本研究利用鏈霉菌FR-008生長(zhǎng)周期短,遺傳操作簡(jiǎn)單,產(chǎn)素水平高等優(yōu)點(diǎn),建立了一個(gè)體內(nèi)研究多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的生物化學(xué)檢測(cè)方法,并利用該方法揭示了多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)

3、移酶的底物特異性以及影響其催化活性的重要氨基酸殘基,為利用組合生物合成手段產(chǎn)生具有更高藥理活性的多烯類(lèi)衍生物提供了理論依據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴敲除殺念菌素生物合成基因簇中可能負(fù)責(zé)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因fscMI獲得了不再攜帶糖基的殺念菌素糖苷配基,并且在用紅霉素啟動(dòng)子控制下的fscMI基因進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)之后恢復(fù)了產(chǎn)生殺念菌素的能力,證明FscMI參與催化了氨基海藻糖的加載,是一個(gè)多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶。同時(shí),多烯類(lèi)抗生素制霉菌素、

4、兩性霉素以及匹馬霉素生物合成基因簇中的同源蛋白(NysDI、AmphDI、PimK)也都能夠識(shí)別殺念菌素糖苷配基,并且在不同程度上恢復(fù)fscMI缺失突變株LX1中殺念菌素的產(chǎn)量,證明多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖苷配基的底物特異性并不是非常嚴(yán)格。
　?、茷榱私沂咎腔D(zhuǎn)移酶在糖苷配基也即聚酮骨架上的識(shí)別基團(tuán),本研究構(gòu)建了DH11的點(diǎn)突變菌株LX8。DH11位于殺念菌素生物合成基因簇的聚酮合酶FscD上,負(fù)責(zé)殺念菌素結(jié)構(gòu)中C22-C23位上雙鍵

5、的形成,該鍵處于多烯類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)保守區(qū)并且是距離氨基海藻糖最近的一個(gè)雙鍵。突變株LX8不再產(chǎn)生殺念菌素,經(jīng)LC-MS、Q-TOF以及特征紫外吸收峰的檢測(cè)確定該突變株產(chǎn)生了兩個(gè)具有相同分子量([M+H]+=1,127.3)以及預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)式的殺念菌素六烯衍生物,[M+H]+1,127.3證明C23位已經(jīng)被羥基取代,并且氨基海藻糖仍然能夠加載,推測(cè)這兩個(gè)新的化合物是由糖基加載在原始的C21位或新形成的C23位羥基上所引起的。該結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明

6、多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖苷配基底物具有一定的選擇寬泛性。
　?、峭ㄟ^(guò)對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶FscMI的同源建模找到可能在糖基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的氨基酸殘基,并用定點(diǎn)突變的方法分別將這些氨基端殘基進(jìn)行了突變,得到一系列糖基轉(zhuǎn)移酶FscMI的突變體。體內(nèi)對(duì)這些 FscMI突變體識(shí)別天然底物的能力進(jìn)行了定量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Ser346、Ser361、His362和Cys387顯著影響FscMI催化能力。這是首例對(duì)多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶中重要氨基酸殘基的研究,為

7、今后通過(guò)定向突變的方式改變多烯類(lèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性,擴(kuò)大其糖苷配基和糖基的識(shí)別范圍從而得到具有更高藥用價(jià)值的多烯類(lèi)抗生素衍生物提供了理論依據(jù)。
　　⑷對(duì)殺念菌素生物合成基因簇中存在的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因fscTI和fscTII的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。通過(guò)遺傳操作手段,構(gòu)建了一個(gè)用于敲除轉(zhuǎn)運(yùn)基因fscTI和fscTII的同源重組雙交換質(zhì)粒,并通過(guò)接合轉(zhuǎn)移獲得了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失突變株LX10,對(duì)該突變株的發(fā)酵檢測(cè)顯示它不再產(chǎn)生多烯類(lèi)