釀酒酵母β-D-葡聚糖制備、構(gòu)象及免疫功效研究.pdf

1、β-D-葡聚糖存在于許多細(xì)菌、真菌和高等植物中，它的一個(gè)重要來(lái)源是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞壁。大量研究表明酵母β-D-葡聚糖可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞以起到抗腫瘤、抗菌、愈合傷口、抗氧化和降血脂等功效。此外，酵母β-D-葡聚糖在食品工業(yè)中被廣泛用作于增稠劑、乳化穩(wěn)定劑和脂肪替代品。 目前國(guó)際上還沒(méi)有酵母β-D-葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。常規(guī)酵母β-D-葡聚糖的測(cè)定一般采用苯酚-硫酸法，測(cè)定結(jié)果誤差較

2、大。在此，本研究建立了一個(gè)酵母β-D-葡聚糖測(cè)定的新方法：首先利用渦流微珠破壁法對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁，酵母細(xì)胞破壁率可達(dá)到95.28％；接著采用高濃度酸預(yù)處理結(jié)合常規(guī)酸水解方法對(duì)酵母β-D-葡聚糖進(jìn)行酸水解，酵母β-D-葡聚糖的酸解回收率高達(dá)98.76％；車(chē)此基礎(chǔ)上，由GOPOD法測(cè)定出β-D-葡聚糖的含量。新方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差和加樣回收率分別為0.46％和99.96％。 采用新方法對(duì)不同釀酒酵母菌種的β-D-葡聚糖含量進(jìn)行了分析對(duì)

3、比，結(jié)果表明酵母中β-D-葡聚糖含量隨其菌種不同而有明顯差異(P≤0.05)，占細(xì)胞壁干重比率的最大差異為138.10％，而占細(xì)胞干重比率的最大差異高達(dá)189.52％。 接下來(lái)對(duì)釀酒酵母的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)的研究，并在此基礎(chǔ)上，以二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到培養(yǎng)基模型方程為：Y=106.89+3.74X<,1>-8.85X<,1><'2>-5.72X<,2><'2>-7.96X<,3><'2>-7.52X

4、<,4><'2>，經(jīng)二次多項(xiàng)式逐步回歸分析確定了最佳培養(yǎng)基(/100ml)為：葡萄糖3.27 g、蛋白胨(2)1.89 g、酵母膏1.57 g和甘油1.04 g。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化后，酵母β-D-葡聚糖產(chǎn)量由原來(lái)的65.80．mg/100ml提高到109.33 mg/100ml。然后，采用正交優(yōu)化方法進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定主次影響因素依次為：裝液量>溫度>起始pH>接種量，最適培養(yǎng)條件為：pH5.0、接種量5ml/100ml、溫度32℃、

5、裝液量60 ml/瓶，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證β-D-葡聚糖量達(dá)到128.30 mg/100ml，較發(fā)酵條件優(yōu)化前提高了17.35％。 在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，以L(fǎng)ogistic、BoxLucas1和SRichards2三種模型對(duì)酵母菌生物量和β-D-葡聚糖生成量進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，確定生物量模型以L(fǎng)ogistic模型擬合效果最佳，擬合方程：y=1317.3-1208.9/1+(x/10.6)<'2.7>,相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.975，而在β-D-葡

6、聚糖生成模型擬合中，以SRichards2模型最佳，擬合方程：y=127.51[1-0.47e<'-0.12(x-5.2)]<'2.1>，相關(guān)系數(shù)為0.996；在對(duì)基質(zhì)(葡萄糖)的消耗擬合中，采用Exponemtial ExpDecl模型，擬合方程：y=-0.232+31.287e<'-x/31.174>，相關(guān)系數(shù)為0.977。 傳統(tǒng)酵母β-D-葡聚糖的制備主要采用酸堿法，這易使β-D-葡聚糖發(fā)生氧化降解，致使得率偏低，并且會(huì)對(duì)

7、β-D-葡聚糖的天然構(gòu)象部分地破壞而使其生理活性受到嚴(yán)重的影響。基于此，本文建立一個(gè)由釀酒酵母中分離提取β-D-葡聚糖的新方法，此方法是在較為溫和的條件下進(jìn)行的，包括酵母的誘導(dǎo)自溶、高溫和有機(jī)溶劑的抽提、均質(zhì)破壁、生物酶解等步驟。新方法制備的β-D-葡聚糖純度高達(dá)9396，得率為酵母細(xì)胞干重的11％。 酵母β-D-葡聚糖不溶性制約其在工業(yè)中的應(yīng)用，本研究采用超聲修飾和均相硫酸酯化技術(shù)對(duì)酵母β-D-葡聚糖進(jìn)行修飾改性研究。以400

8、W的功率對(duì)酵母β-D-葡聚糖進(jìn)行超聲處理，每循環(huán)處理時(shí)間24s，間歇時(shí)間6s，共20個(gè)循環(huán)，酵母β-D-葡聚糖的平均粒徑由起始的56.49 μm降到2.33 μm；在Urea-DMSO的均相體系中，以硫酸為酯化劑，對(duì)酵母β-D-葡聚糖進(jìn)行均相硫酸酯化反應(yīng)，硫酸濃度5％，100℃下反應(yīng)4 h，最終酯化β-D-葡聚糖的取代度和得率分別為0.43和87.97％。 采用了FTIR、EA和NMR等方法對(duì)酵母β-D-葡聚糖及其硫酸酯的基本結(jié)

9、構(gòu)進(jìn)行分析，確定酵母β-D-葡聚糖以β-(1，3)為主鏈，其中新方法制備β-D-葡聚糖以β-(1，3)為主鏈每九個(gè)單元與一分子葡萄糖通過(guò)β-(1，6)鍵連接，而酸堿法制備β-D-葡聚糖以β-(1，3)為主鏈每五個(gè)單元與一分子葡萄糖通過(guò)β-(1，6)鍵連接；酵母β-D-葡聚糖硫酸酯化學(xué)通式為(C<,6>H<,10>O<,5>)<,20>·9SO<,3>·20H<,2>O，硫酸基團(tuán)取代位置在糖環(huán)的C-6上。此外，本研究還采用激光光散射(MA

10、LLs)技術(shù)結(jié)合YFY和KP蠕蟲(chóng)模型的方法進(jìn)行研究。判定酵母β-D-葡聚糖硫酸酯溶液構(gòu)象為一種介于柔性鏈和剛性鏈之間的半剛性鏈構(gòu)象，并得到其分子層面的構(gòu)象參數(shù)：M<,L>=646nm<'-1>，q=5.1 nm，d=0.99nm，C<,∞>=16.33。 最后通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，證實(shí)酵母β-D-葡聚糖及其硫酸酯具有增強(qiáng)免疫功效，其中新方法制備酵母β-D-葡聚糖對(duì)Con A誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)轉(zhuǎn)化率具有極顯著性差異(P<0.01)，對(duì)小鼠NK