長枝木霉SMF2peptaibols合成酶和蛋白酶基因敲除體系的構(gòu)建及其peptaibols在植物生長中的功能研究.pdf

1、木霉（Trichodermaspp.）是一種腐生型絲狀真菌，廣泛分布在土壤、植物根際和葉面。木霉是一種重要的生防因子，對多種植物病原真菌具有很強的抑制作用。其生防作用機制包括抗生作用、重寄生作用、競爭作用和誘導植物抗性等。Peptaibols等次級代謝產(chǎn)物和胞外酶類在木霉的抗生作用的過程中發(fā)揮著重要的作用。長枝木霉SMF2(T.longibrachiatumSMF2，SMF2)菌株是本實驗室篩選到的具有較強生防活力的菌株，前期研究發(fā)現(xiàn)其

2、能夠產(chǎn)生多種細胞壁降解酶(cellwalldegradeenzymes，CWDEs)和peptaibols類抗菌物質(zhì)-Trichokonins。Trichokonins的主要組分TrichokoninⅥ(TKⅥ)含有20個氨基酸殘基。本實驗室已建立了Trichokonins的固體發(fā)酵技術(shù)和簡單高效的分離純化技術(shù)。在此基礎上對其生物學活性進行了系列研究，Trichikonins具有抗菌、抗病毒、誘導腫瘤細胞凋亡和誘導植物抗性等多種生物學活

3、性。前期實驗還發(fā)現(xiàn)，低濃度的TrichokoninⅥ能夠促進植物根系的生長發(fā)育而高濃度處理則抑制根系生長，但其與植物的相互作用機制尚未研究，目前也缺乏peptaibols與植物相互作用機制的研究。
　　本研究在前期工作的基礎上，根據(jù)SMF2的基因組的分析結(jié)果，找到該菌株基因組中含有2個長的非核糖體合成酶(Non-ribosomalpeptidesynthetase，NRPS)編碼基因負責peptaibols的合成，分別命名為tpx

4、1和tpx2，其分別含有20個module和12個module。本研究根據(jù)同源重組原理，選用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph和乙酰胺酶基因amdS作為篩選標記，構(gòu)建了peptaibols合成酶基因的敲除載體，通過PEG-CaCl2轉(zhuǎn)化法，對tpx1，tpx2進行基因敲除，通過PCR篩選和Southern雜交驗證，獲得了SMF2tpx1和tpx2基因缺失的SMF2突變株。
　　Peptaibols合成酶缺失突變株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析證實

5、含有20個module的peptaibols合成酶基因tpx1控制一系列含有20個氨基酸的peptaibols的合成，而含有12個module的peptaibols合成酶基因tpx2控制含有12個氨基酸殘基的peptaibols的生物合成。表型分析發(fā)現(xiàn)，peptaibols合成酶的缺失對木霉菌落形態(tài)、菌絲的生長和孢子的形成等生物學特征沒有顯著的影響。
　　體外研究表明，木霉Trichokonins能夠影響植物的生長發(fā)育，但是目前還

6、缺乏SMF2與植物互相作用實驗的證實。本研究采用番茄作為實驗植物，進行盆栽實驗，研究了SMF2野生型菌株及其peptaibols合成酶缺失突變株對植物生長發(fā)育的影響。實驗結(jié)果表明:野生型SMF2能夠促進番茄生長，提高番茄生物量，促進根系的發(fā)育，而peptaibols合成酶的缺失，尤其是tpx2的缺失，影響木霉菌株對植物生長的促進作用。因此peptaibols的產(chǎn)生是木霉促進植物生長的機制之一。研究還發(fā)現(xiàn)，野生型和突變株與對照相比，都具有

7、一定的促生作用，這表明SMF2中的其他生物活性物質(zhì)也可能在其促生作用中發(fā)揮著作用。
　　前期研究還發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶SprT具有很好的抗菌、殺線蟲活性，本研究根據(jù)同源重組原理，選用hph作為篩選標記，運用融合PCR技術(shù)構(gòu)建了sprT基因敲除載體，通過基因敲除方法獲得SMF2sprT缺失突變子。絲氨酸蛋白酶sprT缺失突變株表型分析表明sprT的缺失不影響SMF2菌絲的生長、菌落形態(tài)和孢子的形成。突變株固體發(fā)酵粗提液的蛋白酶酶活下降，