核酸末端保護新方法的研究及其在生物檢測中的應用.pdf

1、在化學、生物、醫(yī)學領域發(fā)現(xiàn)與蛋白質結合的小分子配體或者是和有機小分子結合的蛋白質受體是至關重要的。尤其是，和特定蛋白質具有合理親和性和特異性結合的有機小分子是非常有價值的探針探測蛋白質功能用于化學基因組學的研究，并且可以視蹤蛋白質在細胞上的位置和分布用于分子診斷學的探索，同樣，考察有機活性小分子和蛋白質的相互作用也是藥物研究的主要出發(fā)點。目前，用于確定小分子配體、蛋白質受體以及他們之間相互作用方法包括親和色譜、動力學毛細管電泳、熒光共振

2、能量轉移、以及酶片段互補分析等。盡管這些經典的分析方法對于研究小分子和靶蛋白的相互作用是非常重要的，但是這些方法需要有昂貴的儀器、特殊的信號轉換方式、以及表面固定化等缺點。
　　 由于DNA寡核苷酸鏈據(jù)有靈活多樣的放大方法和檢測方式，小分子連接的DNA用于研究小分子和其結合蛋白相互作用無疑是一個比較吸引人的工具，為小分子和蛋白質相互作用的研究提供了一個新的思路。小分子連接的DNA作為一個巧妙的工具越來越多的用于化合物的合成和篩選

3、。盡管如此，DNA連接的小分在生物傳感的研制方面仍然處于初始狀態(tài)，本論文針對這些問題，基于小分子連接的DNA和末端保護分析思想發(fā)展了一系列生物傳感方案用于小分子-蛋白質相互作用的研究以及基因分型和酶的活性等和重大疾病相關的檢測。
　　 (1)小分子連接的DNA作為一個靈活的工具在探測有機小分子和小分子受體的相互作用的研究領域扮演了至關重要的角色。在第二章報道了小分子連接DNA的末端保護分析方法，這個分析是基于我們新的發(fā)現(xiàn)即單鏈D

4、NA末端修飾的小分子和小分子結合蛋白相互作用能夠保護單鏈DNA不被ExoⅠ降解。這個發(fā)現(xiàn)轉化小分子和蛋白質相互作用的問題為DNA序列是否存在問題，因此可以用DNA序列的放大方法和檢測技術探測小分子-蛋白質相互作用。
　　 基于上述思想，本章發(fā)展了一種靈敏的電化學生物傳感技術用于研究小分子蛋白質相互作用。用小分子標記的DNA通過非共價作用修飾于單壁碳納米管(SWNTs)的表面，使SWNTs能夠均勻地分散于水溶液中，若沒有小分子結合

5、蛋白的存在，Exo I能夠降解SWNTs表面的DNA鏈，使SWNTs在16-巰基十六酸(MHA)絕緣膜上自組裝，由于碳納米管的隧道效應，使溶液中的電活性物質和電極之間能夠有效的發(fā)生電子傳遞，產生電流信號；在小分子結合蛋白存在的情況下，由于結合蛋白和小分子作用阻礙了ExoⅠ對于SWNTs表面DNA寡核苷酸鏈的降解，DNA修飾的SWNTs不能在MHA絕緣膜上組裝，也就沒有電流信號產生。實驗結果表明，這個發(fā)展的方案的確能夠實質性地放大電化學信

6、號并且有較小的背景電流。用這種新奇的電化學傳感方案對小分子葉酸(FA)和腫瘤標志物葉酸受體(FR)的相互作用進行定量分析，動態(tài)響應范圍為10 pM到1 nM，檢測下限為3 pM。該方法靈敏度高，選擇性好。
　　 (2)基于末端保護分析思想結合DNA靈活多樣的檢測方式，在第三章中發(fā)展了幾種無標記的光化學生物傳感技術用于小分子和蛋白質相互作用的研究。具有催化活性的核酸酶(DNAzymes)作為催化標記物用于生物傳感信號放大逐漸吸引了

7、更多的興趣，比如富含G的核酸適配體(Aptamer)和血紅素形成復合物能夠模擬過氧化氫酶的活性。因此，我們在血紅素核酸適體3’末端修飾小分子，小分子和結合蛋白作用后阻礙Exo I對血紅素核酸適體的降解，核酸識體和血紅素結合在H2O2的存在下催化ABTS顯色，把這種顯色方法用于對FR定量檢測，線性檢測范圍是1nM～100 nM，檢測下限為0.1 nM。蛋白質和標記在DNA末端的小分子作用阻礙ExoⅠ對DNA鏈的降解，也可以對保留的DNA鏈

8、進行實時熒光定量(RT-PCR)檢測，從而快速、靈敏檢測小分子結合蛋白，以葉酸-FR為模型體系，對FR檢測的線性范圍為100 fM～1 nM。一端小分子修飾另一端巰基修飾的DNA鏈通過金-巰鍵標記到納米金上，小分結合蛋白和小分子相互作用阻礙了ExoⅠ對納米金上DNA鏈的降解，因此納米金顆粒能夠均勻地分散于緩沖溶液中，若沒有小分子結合蛋白的存在，納米金表面修飾的DNA鏈完全被ExoⅠ降解，納米金團聚變色，因此引起納米金溶液顏色和吸光度值的

9、變化?；谀┒吮Ｗo分析構建的納米金變色傳感器用于葉酸-FA的特異性檢測，檢測范圍是1nM～100 nM。本章發(fā)展的三種末端保護均相分析方法均具有操作簡單，快速靈敏的特點。
　　 (3)鑒于前兩章中發(fā)展的電化學和光化學生物傳感方案是基于ExoⅠ的末端保護分析方法發(fā)展起來的，在第四章我們把末端保護的分析思想進一步推廣，并且驗證了DNA的3’或者5’末端修飾的小分子官能團和目標蛋白結合后同樣也能夠有效地阻止各種單鏈特異性核酸外切酶和雙

10、鏈特異性的核酸外切酶對DNA鏈的酶切降解。這個推廣把小分子-蛋白質相互作用的分析轉化為對不同DNA結構的分析，為小分子或者蛋白質的檢測提供了一個有用的機制。基于這種機制，本章發(fā)展了一種基于熒光染色的無標記均相生物傳感方案用于小分子-蛋白質相互作用的檢測。同時，利用這種機制發(fā)展了一種基于聚合酶延伸單個小分子修飾的核苷用于無標記的SNP基因分型檢測。
　　 小分子-蛋白質相互作用以biotin-SA和FA-FR為模型體系分別對SA和

11、FR進行檢測，動態(tài)響應范圍分別為0.5 nM～100 nM和1 nM～200 nM，檢測限分別為0.1 nM和0.4nM；SNP基因分型檢測的動態(tài)響應范圍為0.1 nM～200 nM，檢測限為0.02 nM。除了較好的靈敏度之外，本章發(fā)展的方案也具有較高的選擇性、極好的重現(xiàn)性、低成本、操作簡單等優(yōu)點，使其在分子診斷、基因組研究方面有著潛在的應用價值。
　　 (4)由于前幾章中發(fā)展的末端保護分析方法適用于考察解離常數(shù)在納摩爾范圍的

12、小分子和蛋白質作用分子對，為了更進一步拓寬末端保護的分析應用范圍，結合活性探針、光交聯(lián)技術、共價捕獲技術等最新發(fā)展的生物分析手段，把小分子修飾的DNA共價交聯(lián)到要檢測的目標蛋白上，產生永久性的保護，可以使末端保護分析不受分子作用對解離常數(shù)的限制。在第五章中發(fā)展了一種基于共價捕獲的納米金變色生物傳感技術用于酶的活性檢測。把酶作用的底物通過巰基修飾到納米金上，使納米金能夠有效地分散于緩沖溶液中，用ExoⅠ和ExoⅢ降解處理后，納米金團聚變色