熱纖梭菌纖維素內切葡聚糖酶在釀酒酵母細胞表面上的展示及其性質研究.pdf

1、纖維素是一種可再生資源,且是地球上數量最大的。但是由于纖維素具有木質素外被以及水不溶性的高結晶結構,所以纖維素被水解為可利用的小分子葡萄糖是相當困難的。這也就導致了纖維素的利用率極低。而纖維素酶是能夠將纖維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱,包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。但是纖維素酶的生產成本高且活性很低,這兩個限制纖維素應用的瓶頸問題成為纖維素研究的熱點與難點。隨著基因工程技術的發(fā)展,采用不同的表達載體進行重組蛋白的表達,

2、使得這一難題得到緩解。
　　對本實驗室保存的一株產纖維素內切葡聚糖酶的厭氧熱纖梭菌進行研究,首先提取基因組總 DNA,根據熱纖梭菌纖維素內切葡聚糖酶基因序列和釀酒酵母細胞表面展示質粒載體 pYD1上的多克隆位點設計引物并進行 PCR擴增,連接到載體并轉化入大腸桿菌宿主細胞,篩選后進行序列測定及比對。然后將該基因連接到表面展示質粒載體 pYD1上,并轉化用于表面展示釀酒酵母 EBY100菌株中,挑選陽性轉化子,經酵母菌落 PCR證實

3、纖維素內切葡聚糖酶基因已成功整合到酵母基因組中。接著,用2％的半乳糖進行誘導表達,后用剛果紅平板法對誘導表達的結果進行初步鑒定,重組酶點種后平板出現透明圈。最后用DNS法測其表面展示酶的酶活及其性質研究。
　　通過對表面展示的纖維素內切葡聚糖酶的酶學性質研究,發(fā)現此酶的最適反應溫度是50℃,同時在 pH4.6時該表達產物具有較高的酶活;最適反應時間為10min,用2％的半乳糖誘導表達60h后酶活達到最高,為32IU/ml,較天然酶