離體大鼠表皮干細胞熱損傷模型制作的研究.pdf

1、第一部分：分離鑒定SD鼠表皮干細胞
　　目的：對SD大鼠表皮干細胞進行分離培養(yǎng)，并對所培養(yǎng)表皮干細胞形態(tài)，細胞表面標(biāo)志物進行檢測，以確保所培養(yǎng)的細胞群為富集了表皮干細胞的細胞群。
　　方法：利用胰酶消化法分離大鼠表皮干細胞，Ⅳ型膠原差速貼壁法進行篩選，克隆實驗來鑒定細胞增殖能力，免疫熒光共染角蛋白19及β1整合素，聯(lián)合陰性標(biāo)記物角蛋白10，進行表型鑒定。
　　結(jié)果：倒置相差顯微鏡所得細胞形態(tài)多呈類圓形、體積小、核大，增

2、殖后期可見馬路石樣結(jié)構(gòu)。熒光檢測結(jié)果表明所細胞β1整合素及角蛋白19共表達，陰性標(biāo)記物角蛋白10無明顯表達?？寺⌒纬蓪嶒烇@示所分離的細胞有較強的增殖能力。
　　結(jié)論：成功建立了獲得表皮干細胞體外分離的方法
　　第二部分：SD鼠離體表皮干細胞熱損傷模型建立
　　目的：體外建立SD鼠ESCs熱損傷模型，研究皮膚燒傷后ESCs生物學(xué)變化。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠表皮干細胞，實驗組細胞在水浴鍋中分別以51、52、53、5

3、4℃孵育30s，對照組細胞37℃孵育30s，每組重復(fù)3次。用流式細胞儀對細胞存活率進行定量分析，熱損傷后干細胞內(nèi) HSP70蛋白表達量的變化通過免疫印跡試驗檢測，使用實時熒光定量PCR法檢測HSP70 mRNA的變化。
　　結(jié)果：隨著熱損傷溫度的升高，表皮干細胞中凋亡和死亡細胞逐漸增加，細胞存活率逐漸下降；52℃時表皮干細胞存活率為85.2％，53℃時為83.7%，54℃存活率為53.2%。Western blot檢測結(jié)果顯示隨溫

4、度升高HSP70表達量升高，53℃達到高峰，54℃時表達量開始下降當(dāng)仍比對照組高。RTqPCR檢測結(jié)果顯示HSP70mRNA表達量在一定范圍內(nèi)隨溫度升高而增加，以53℃的HSP70mRNA表達量最為顯著（P<0.05），而在54℃，55℃時表達量急劇下降并且與對照組相比顯著降低。
　　結(jié)論：熱損傷能造成離體大鼠表皮干細胞凋亡，HSP70表達量在一定溫度范圍內(nèi)增高并為細胞提供保護作用，53℃孵育30s為構(gòu)建表皮干細胞熱損傷模型的較好