重組人胰高血糖素樣肽-1前藥(Pro-rhGLP-1)的表達、純化及藥效學研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿?。―iabetes mellitus,DM）是嚴重威脅人類健康和生命的重大疾病，發(fā)病率和病死率逐年攀升，并呈年輕化趨勢?；颊咧屑s95％為2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM），病情控制現(xiàn)狀令人堪憂。目前治療T2DM的藥物仍以磺酰脲類、雙胍類等口服降糖藥為主，但該類藥物最常見最危險的不良反應是引起持久性的低血糖，長期使用會因胰島素過度分泌而導致胰島β細胞功能衰竭。此外，由于T2

2、DM的傳統(tǒng)治療側重于緩解高血糖癥狀，而不是針對其真正發(fā)病原因，致使多數(shù)患者都無法逆轉血糖控制能力的持續(xù)下降、β細胞數(shù)量的減少和功能的降低，因此研發(fā)療效更好、使用安全，能夠有效控制糖尿病多種癥狀及并發(fā)癥的新型治療藥物，是當今新藥研發(fā)領域的熱點和重點。
　　研究目的：
　　胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）是一種重要的腸道內(nèi)分泌激素，具有降低過高血糖、促進胰島素分泌、刺激胰島β細胞增

3、殖、抑制胰高血糖素分泌、降低胰島素抵抗、延緩胃排空、抑制食欲、保護心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等作用，具備理想降糖藥的多種特征，目前已成為糖尿病治療藥物研究領域倍受矚目的研發(fā)熱點。但由于天然的GLP-1在體內(nèi)極易被DPPIV降解失活，限制了其臨床應用，因此設法延長其作用時間是目前的攻關重點。本課題是在此基礎上，采用前藥設計思路，應用DNA重組技術將多個GLP-1活性分子通過連接肽融和，構建重組人胰高血糖素樣肽-1前藥（Prodrug of reco

4、mbinant human GLP-1,Pro-rhGLP-1），并建立Pro-rhGLP-1的高效表達、純化方法，觀察Pro-rhGLP-1的體內(nèi)外釋藥性能，并對其進行系統(tǒng)的藥效學研究。
　　研究方法：
　　1.Pro-rhGLP-1標簽融合蛋白的表達、純化和活性分析：采用融合標簽技術，將合成的Pro-rhGLP-1基因克隆至大腸桿菌質(zhì)粒載體pET32a(+)中，構建Trx·Tag和His·Tag與Pro-rhGLP-1的

5、融合表達載體pET32a(+)-Pro-rhGLP-1；轉化大腸桿菌BL21(DE3)，構建表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)-Pro-rhGLP-1；IPTG誘導表達，12％SDS-PAGE檢測蛋白表達量并進行可溶性分析；包涵體蛋白經(jīng)洗滌溶解后透析復性；復性成功后采用Ni-NTA親和層析純化Pro-rhGLP-1標簽融合蛋白；純化后經(jīng)腸激酶酶切去除融合標簽；SDS-PAGE和HPLC分析蛋白純度；Western

6、blot鑒定蛋白的特異性；OGTT檢測Pro-rhGLP-1的體內(nèi)生物學活性。
　　2.Pro-rhGLP-1無標簽重組蛋白的表達、純化和活性分析：采用PCR方法擴增Pro-rhGLP-1基因序列，克隆入去除標簽的大腸桿菌質(zhì)粒載體pET41a(+)中，同時采用Klenow片段補平酶切后5'末端的方法進行目的基因序列和pET41a(+)的平端連接，構建無標簽表達載體pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)；轉化

7、大腸桿菌BL21(DE3)，0.01mMIPTG誘導目的蛋白表達；包涵體經(jīng)梯度濃度尿素洗滌后溶解在8M尿素中，采用Q-SepharoseFF陰離子交換柱和Superdex75凝膠過濾柱對目的蛋白進行分離純化；蛋白透析復性后去除內(nèi)毒素并冷凍干燥；HPLC分析蛋白純度；Westernblot鑒定蛋白特異性；OGTT檢測目的蛋白的體內(nèi)生物學活性；對凍干后的活性蛋白進行氨基酸組成分析、N末端氨基酸序列測定、C末端氨基酸序列測定、肽圖分析、MAL

8、DI-TOF-MS分析等完成結構確證；完成目的蛋白的結構確證后，保留工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)，并進行傳代穩(wěn)定性研究。
　　3.Pro-rhGLP-1的釋藥性能及藥效學研究：建立Pro-rhGLP-1與人血漿的共孵育體系，在不同時間點取樣，通過Westernblot對Pro-rhGLP-1的降解過程進行特異性分析，再通過ELISA，檢測小鼠皮下注射Pro-

9、rhGLP-1后的不同時間點血漿GLP-1水平，初步評價Pro-rhGLP-1的體內(nèi)外釋藥過程；在離體分離的胰島上觀察Pro-rhGLP-1的體外促胰島素分泌活性；在C57BL/6J和糖尿病db/db小鼠上觀察單次和持續(xù)6周給藥過程中，Pro-rhGLP-1對血糖水平、胰島素分泌量、葡萄糖耐受性、胰島素敏感性、攝食、體重、脂質(zhì)含量及胰島形態(tài)和功能的影響，對Pro-rhGLP-1進行系統(tǒng)的藥效學評價。
　　實驗結果：
　　1．

10、Pro-rhGLP-1標簽融合蛋白的表達、純化和活性分析：成功構建帶有融合標簽Trx·Tag和His·Tag的大腸桿菌表達載體pET32a(+)-Pro-rhGLP-1。0.01、0.1和1.0mMIPTG均能誘導Pro-rhGLP-1標簽融合蛋白的表達，融合蛋白分子量約35KD。融合表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，表達量約為細菌總蛋白的50％。用不含尿素的0.02MPBS洗滌后，少量包涵體可以溶解，含8M尿素的PBS能夠溶解約80％的包

11、涵體蛋白。經(jīng)Ni-NTA親和層析分離純化后，可得到純度為95.43％的目的蛋白。C57BL/6J小鼠的OGTT結果表明，純化后的Pro-rhGLP-1呈劑量依賴性降低血糖濃度，同時升高血漿胰島素水平，等劑量Pro-rhGLP-1的降糖作用較GLP-1作用更強。
　　2．Pro-rhGLP-1無標簽重組蛋白的表達、純化和活性分析：成功構建大腸桿菌表達載體pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)。0.01、0.1

12、和1.0mMIPTG均能誘導Pro-rhGLP-1的表達，分子量約19KD。表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，表達量約占細菌總蛋白60％以上，降低誘導溫度和降低IPTG濃度均未能實現(xiàn)目的蛋白的可溶性表達。用多種不含尿素的緩沖液在不同pH值時洗滌包涵體，效果均不佳，換用梯度濃度尿素對包涵體進行洗滌，8M尿素可以溶解90％以上的包涵體。溶解后的包涵體經(jīng)離子交換和凝膠過濾層析分離純化后，純度達97.55％。透析復性后測定生物學活性，結果表明，Pr

13、o-rhGLP-1在體內(nèi)具有生物學活性，可以降低血糖，升高血清胰島素水平，且降糖作用較GLP-1更強。結構確證結果與預期一致。工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)連續(xù)傳至50代，質(zhì)粒未丟失，表達量穩(wěn)定，表達產(chǎn)物正確。
　　3．Pro-rhGLP-1的釋藥性能及藥效學研究：(1)與血漿共孵育15min后，即可檢測到來自Pro-rhGLP-1的GLP-1，GLP-1釋放量

14、隨時間延長增加，孵育12h后，約80％的產(chǎn)物為GLP-1；(2)C57BL/6J小鼠單次皮下注射Pro-rhGLP-1后12h，血漿中仍可檢測到高于基礎水平的GLP-1；(3)在無血清培養(yǎng)的離體胰島上，Pro-rhGLP-1不能促進葡萄糖依賴性的胰島素分泌，而對照組GLP-1卻可以顯著刺激胰島素分泌，并表現(xiàn)出良好的量效關系；(4)Pro-rhGLP-1(3nmol/kg)降糖作用明顯，糖尿病db/db小鼠單次皮下給藥后的降糖作用可維持至

15、少12h。6周治療過程中，db/db小鼠空腹血糖和HbA1c水平均顯著降低，且在停藥6周后仍維持在較低水平；(5)Pro-rhGLP-1(3nmol/kg)可以顯著促進胰島素分泌，IGI較對照組增加8.2倍；(6)Pro-rhGLP-1可顯著抑制攝食，中劑量(3nmol/kg)給藥后C57BL/6J小鼠的24h攝食量減少了51±11％；給藥6周期間，糖尿病db/db小鼠的攝食量較對照組減少了約32％；(7)Pro-rhGLP-1在有效減

16、輕糖尿病小鼠體重的同時，也顯著降低了體脂含量及血漿中的瘦素、甘油三酯和游離脂肪酸水平；(8)經(jīng)Pro-rhGLP-1治療6周后，db/db小鼠的HOMA-IR下降，QUICKI升高；(9)胰島形態(tài)學分析結果表明，Pro-rhGLP-1治療6周后，db/db小鼠胰島面積增大，數(shù)量增多，還可刺激胰島β細胞增殖。
　　結論：
　　1．我們首次采用前藥設計思路構建了GLP-1前體藥物Pro-rhGLP-1，在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中，

17、建立了Pro-rhGLP-1無標簽重組蛋白的表達和純化方法，獲得了純度大于95％的目標蛋白，為Pro-rhGLP-1作為藥用蛋白的獲得提供了簡便易行的方法。
　　2．體外無藥理活性的Pro-rhGLP-1進入體內(nèi)后可以緩慢降解，釋放出多個GLP-1活性分子，釋放時間長達12h以上。
　　3．在離體培養(yǎng)的胰島上，Pro-rhGLP-1沒有促胰島素分泌效應。但在動物實驗中，呈劑量依賴性的增加胰島素分泌量并降低血糖，且不降低正常血