TIEG1基因在TGF-β1介導肝癌細胞生長抑制中的作用及抗腫瘤研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分TIEG1基因在TGF—β1介導肝癌細胞生長抑制中的作用 研究背景：肝癌是世界上第五大惡性腫瘤，晚期患者治療難度大、療效差，目前尚無有效的治療策略。因此研究肝癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和療法是目前研究熱點。TGF—β在體外能抑制肝細胞增殖和誘導細胞凋亡，在體內(nèi)控制肝細胞的生長，維持肝臟大小。然而，在肝癌細胞中，往往對TGF—β失去敏感性，被認為是肝癌發(fā)病的機制之一，但其機理尚未完全

2、闡明。 研究目的：通過篩選對TGF—β1不同敏感程度的細胞株(包括正常肝細胞和肝癌細胞)，以此為模型，研究肝癌細胞對TGF—β敏感性缺失的主要原因以及TIEG1抑制肝癌細胞生長的作用機制。 研究方法：選取了對TGF—β敏感的肝癌細胞株Hep3B和正常永生化的肝細胞株MIHA，以及對TGF—β不敏感的兩株肝癌細胞株(HepG2、Bel7404)做為細胞模型。TGF—β1處理0、0.5、1、2、4h后，RF—PCR方法檢測T

3、GF—β不同敏感程度的細胞株之間TGF—β信號通路主要相關基因表達的差異；利用siRNA抑制TGF—β敏感肝癌細胞Hep3B的TIEG1表達，觀察細胞對TGF—β1敏感性的改變；利用慢病毒載體在TGF—β不敏感肝癌細胞(HepG2、Bel7404)中過表達TIEG1，研究TIEG1在TGF—β1對肝癌細胞生長抑制中的作用。Westernblot檢測TGF—β1和TIEG1對stathmin表達的影響；螢光素酶報告基因檢測TIEG1對st

4、athmin啟動子的調(diào)控；采用染色質免疫共沉淀方法，觀察TIEG1對stathmin啟動子區(qū)域的直接結合作用；并進一步在TIEG1過表達的肝癌細胞中同時過表達stathmin，研究對逆轉TIEG1抑制細胞生長的作用。 研究結果：(1)在檢測TGF—β1處理細胞后的早期基因反應中，發(fā)現(xiàn)在TGF—β敏感的細胞(Hep3B、MIHA)中，TGF—β1能強烈誘導TIEG1基因表達上調(diào)(7～11倍)，并在1h時達到高峰；而在對TGF—β不

5、敏感的細胞(HepG2、Bel7404)中，TIEG1基因表達只有微弱的上調(diào)(2～3倍)，TGF—β敏感的細胞中TIEG1基因表達變化顯著高于TGF—β不敏感的細胞。(2)應用siRNA抑制TGF—β敏感肝癌細胞Hep3B中TIEG1基因表達，可以使Hep3B細胞對TGF—β1的敏感性降低。(3)在TGF—β不敏感的肝癌細胞(HepG2、Bel7404)中過表達TIEG1，可以抑制肝癌細胞的增殖和誘導凋亡。(4)TIEG1可以通過直接結

6、合stathmin啟動子區(qū)域，調(diào)控啟動子活性，下調(diào)stathmin的表達；TGF—β1處理敏感肝癌細胞Hep3B也可使stathmin表達下調(diào)。(5)在TIEG1過表達的肝癌細胞中同時過表達stathmin，可以明顯逆轉TIEG1對肝癌細胞的生長抑制作用。 結論：(1)TGF—β1處理后，TIEG1基因早期表達反應能力的減弱，是導致肝癌細胞對TGF—β1喪失敏感性的主要原因。(2)闡明了TGF—β1對TIEG1基因及下游stat

7、hmin的調(diào)控作用，提出假設的“TGF—β1→TIEG1→stathmin→細胞增殖抑制”新的信號通路，揭示TIEG1基因在TGF—β1介導肝癌細胞生長抑制中的重要作用。本研究為探討肝癌發(fā)病機制，尋找新的治療靶點提供了實驗依據(jù)。 第二部分慢病毒載體過表達TIEG1對胰腺癌細胞生長抑制和化療藥物的增敏作用 研究背景：胰腺癌是目前已知的惡性程度最高的腫瘤之一。近年來，人胰腺癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重影響著人們的生活質

8、量。大部分胰腺癌細胞對化療藥物耐藥，導致胰腺癌預后極差。尋找更加有效的治療方法，成為目前胰腺癌治療的關鍵。TIEG1可以誘導TGF—β敏感胰腺癌細胞凋亡，抑制細胞生長，但對TGF—β不敏感胰腺癌細胞生長和化療藥物敏感性的影響尚未闡明。 研究目的：研究在胰腺癌細胞中過表達TIEG1對胰腺癌細胞生長和化療藥物敏感性的影響，并探討其作用機制。 研究方法：利用慢病毒轉基因系統(tǒng)，在胰腺癌細胞株(SW1990和Canpan-2)以及

9、永生化正常胰腺導管細胞株(HPDE6—E6E7—c7)中過表達TIEG1，MTT法測定其對胰腺癌細胞和正常細胞生長抑制作用的差異；DAPI染色法檢測TIEG1對胰腺癌細胞凋亡的影響；MTT法測定過表達TIEG1后，胰腺癌細胞對化療藥物吉西他濱敏感性的改變；實時定量PCR和Westernblot方法檢測TIEG1對胰腺癌細胞stathmin表達的影響；用慢病毒過表達stathmin，研究對逆轉TIEG1抑制胰腺癌細胞生長的作用；利用特異性

10、siRNA抑制stathmin的表達，觀察對胰腺癌細胞生長的影響。 研究結果：(1)慢病毒載體過表達TIEG1基因能抑制胰腺細胞生長，并且在腫瘤細胞中抑制效果明顯高于正常胰腺癌細胞株，具有統(tǒng)計學意義。(2)過表達TIEG1基因可以誘導胰腺癌細胞凋亡，促進腫瘤細胞對化療藥物吉西他濱的敏感性。(3)TIEG1可以下調(diào)胰腺癌細胞stathmin的表達；同時用慢病毒轉染方法過表達stathmin可以一定程度逆轉TIEG1基因對腫瘤細胞的