重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備及聚乙二醇修飾.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學碩士學位論文重組人腫瘤壞死因子α衍生物的制備及聚乙二醇修飾姓名：畢研偉申請學位級別：碩士專業(yè)：免疫學指導教師：徐維明李健峰20080601中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院碩士研究生畢業(yè)論文摘要摘要腫瘤壞死因子一a(TNF一Ⅱ)是一種抗腫瘤細胞因子，對各種腫瘤細胞有直接細胞毒作用，可激活機體的抗腫瘤免疫反應，引起腫瘤的缺血性壞死，其作為一種潛在的抗腫瘤藥物的開發(fā)前景引起國內外的廣泛重視。目前，其在國內外臨床上有廣泛的應用，常用

2、于肝癌、宮頸癌的治療，雖然其抗腫瘤的功能得到了充分的肯定，但是在使用過程中仍具有毒副作用、穩(wěn)定性差、半衰期短等缺點。蛋白質PEG修飾技術在過去的近15年中得到了快速發(fā)展，已有多篇文獻報道，蛋白質藥物經PEG修飾后降低了免疫原性、提高了穩(wěn)定性、延長了半衰期，并用于臨床治療各種疾病。本文擬通過對腫瘤壞死因子一Q衍生物的聚乙二醇修飾，獲得低毒性、低免疫原性、高穩(wěn)定性的腫瘤壞死因子一a。對天然TNF—Q結構與功能關系的研究表明，適當改變其結構，

3、可提高其殺傷腫瘤細胞的活性，降低其對組織器官的毒副作用。本研究應用搭橋PCR技術，將腫瘤壞死因子一a基因的前4位氫基酸的編碼序列刪除，對hTNF—a的第8／9／10／29／3l／157位氨基酸的密碼子進行定點突變，將突變后的cDNA插入到pBV220載體中構建重組質粒pBV220一tnfaD4。將重組質粒轉化大腸桿菌DH5Q，篩選獲得了高效表達TNF—QD4突變體的工程菌，表達的重組蛋白約占菌體蛋白總量的45％左右，經硫酸銨沉淀和陽離子

4、交換層析純化得到純度達90％以上的重組目蛋白，比活性達到8x107。在TNF—a的PEG修飾試驗中，應用了三種不同分子量的單甲氧基聚乙二醇丁醛(fⅡPEG一丁醛分子量分別為5k、lOk、20k)對TNFQ衍生物TNF_QD4進行修飾。通過試驗確定了最佳修飾條件，即反應pH6O，TNF_QD4與fnPEG一丁醛(5k)質量比1：2；TNF—QD4與mPEG丁醛(10k)質量比1：4；TNF_QD4與mPEG一丁醛(20k)質量比l：8，反

5、應時間16h為最佳反應條件。修飾產物經陽離子交換層析純化得到了較純的InPEGTNF—QD4，純度達85％以上。隨后，對TNF—aD4聚乙二醇單一修飾產物的部分性質進行了研究，結果表明TNF—QD4及對其的聚乙二醇修飾達到了預期研究目標。mPEG—TNF—QD4(5k)的比活性達至086107、mPEG—TNF—dD4(10k)比活性達至038107、mPEG—TNF—QD4(20k)比活性達至075106。與TNF—aD4相比，mPE