線粒體膜ATP敏感鉀通道在缺氧性肺動脈平滑肌細胞增殖-凋亡失衡中的作用.pdf

1、研究背景
　　 肺動脈高壓和肺心病的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下，嚴(yán)重威脅著人類的健康。缺氧性肺動脈高壓是最常見的類型，其發(fā)病機制目前尚未完全闡述清楚，其中缺氧性肺血管收縮和缺氧性肺血管重建是被認為是其兩大主要的病理生理基礎(chǔ)。目前認為，缺氧引起的肺血管收縮并非完全依賴于血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞也參與了肺血管收縮反應(yīng)。在影響血管張力的各種因素中，血管平滑肌細胞鉀通道和細胞內(nèi)鈣離子發(fā)揮著十分重要的作用。研究表明缺氧可抑制肺動脈平滑

2、肌細胞鉀通道的活性，引起肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)去極化，達到一定閾值后，電壓依賴性鈣通道開放，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，作為重要的第二信使，鈣離子促使肺動脈平滑肌細胞收縮、增殖和遷移，也可激活各種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，進一步引起缺氧性肺血管收縮和肺血管重建，最終導(dǎo)致肺動脈高壓。
　　 第一部分
　　 分題一 線粒體膜ATP敏感鉀通道對缺氧大鼠肺動脈平滑肌細胞細胞內(nèi)細胞色素C分布的變化及細胞增殖中的作用
　　

3、 目的：研究線粒體膜上ATP敏感的鉀通道和線粒體膜電位在缺氧影響大鼠肺動脈平滑肌細胞內(nèi)細胞色素C在細胞漿和線粒體內(nèi)分布的變化及以及其引起細胞增殖變化中的作用，旨在探索缺氧性肺動脈重建和肺動脈高壓形成的發(fā)生機制，為尋找新的防治方法 提供試驗依據(jù)。
　　 方法：獲取大鼠正常肺組織，分離出肺動脈平滑肌細胞進行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①正常對照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide

4、組；④慢性缺氧(CH)組；⑤CH+5-HD組；⑥CH+Diazoxide組。利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像檢測線粒體膜電位，線粒體/胞漿成離試劑盒分離線粒體和胞漿成分后，Western blot法檢測兩者細胞色素C，流式細胞儀檢測細胞周期和MTT法檢測細胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對照組比較，R-123熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞胞漿細胞色素C與線粒體

5、細胞色素C的比值明顯降低，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對照組相比較均P<0.05；而5-HD作用24h與正常對照組比較，上述指標(biāo)無明顯變化，②慢性缺氧24h，結(jié)果與Diazoxide組相似，與正常對照組比較，R-123熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯降低，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對照組相比較均P<0.05；；CH+Diazoxide組，與缺氧組比較，R-12

6、3熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯降低，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少，與正常對照組相比較均P<0.05；CH+5-HD組，與缺氧組比較，R-123熒光強度明顯減弱，線粒體膜電位部分消失，細胞胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯升高，細胞增殖明顯減少、凋亡明顯增多，與正常對照組相比較均P<0.05。
　　 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，缺氧可以引起MitoKATP的開放以及 m

7、的去極化，并進而抑制了細胞色素C從細胞線粒體釋放到細胞漿，抑制線粒體凋亡途徑，從而參與并影響了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。
　　 分題二 線粒體膜ATP敏感鉀通道對缺氧大鼠肺動脈平滑肌細胞氧自由基的變化及細胞增殖中的作用
　　 目的：研究線粒體ATP敏感性鉀通道和線粒體膜電位在缺氧影響大鼠肺動脈平滑肌細胞細胞內(nèi)氧自由基的變化及細胞增殖中的作用，旨在探索缺氧性肺動脈重建和肺動脈高壓形成的發(fā)生機制，為尋找新的防治方法的提供試驗依據(jù)

8、。
　　 方法：獲取大鼠正常肺組織，分離出肺動脈平滑肌細胞進行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①正常對照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④慢性缺氧(CH)組；⑤CH+5-HD組；⑥CH+Diazoxide組。利用激光共焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像檢測線粒體膜電位，熒光染色檢測細胞內(nèi)氧自由基含量，流式細胞儀檢測細胞周期和MTT法檢測細胞增殖情況。
　　

9、 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對照組比較，R-123熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；而5-HD作用24h后，上述指標(biāo)與正常對照組相比較，均無顯著性差異；②慢性缺氧24h，結(jié)果與Diazoxide組相似，與正常對照組比較，R-123熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；CH+Diazoxid

10、e組，與缺氧組比較，R-123熒光強度明顯增強，線粒體膜電位去極化，細胞內(nèi)氧自由基含量明顯增加，細胞呈增殖明顯增多、凋亡明顯減少；CH+5-HD組，與缺氧組比較，R-123熒光強度明顯減弱，線粒體膜電位部分消失，細胞內(nèi)氧自由基含量明顯下降，細胞呈增殖明顯減少、凋亡明顯增多。
　　 結(jié)論：本實驗結(jié)果顯示，Diazoxide能夠通過開放線粒體膜上ATP敏感的鉀通道，引起Δψm去極化，Δψm的變化影響細胞內(nèi)氧自由基的含量，氧自由基作為

11、信號分子影響肺動脈平滑肌細胞的增殖/凋亡的平衡。
　　 第二部分
　　 分題一 線粒體膜ATP敏感鉀通道對缺氧人肺動脈平滑肌細胞細胞內(nèi)細胞色素C分布的變化及細胞增殖中的作用
　　 目的：為了探索線粒體ATP敏感鉀通道和線粒體膜電位在細胞缺氧信號傳導(dǎo)中的作用以及在缺氧性人肺動脈平滑肌細胞細胞色素C在細胞內(nèi)的分布及細胞增殖中的影響。
　　 方法：本實驗將人動脈平滑肌細胞進行常氧或24小時缺氧培養(yǎng)，并將標(biāo)本分為

12、六組：①對照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④24小時缺氧組；⑤24小時缺氧合并5-HD組；⑥24小時缺氧合并Diazoxide組。利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP-1 USA)成像法檢測線粒體膜電位；線粒體/胞漿成分分離試劑盒(BioVision)分離線粒體和胞漿成分后，Western blot法檢測兩者細胞色素C；Western blot法檢測細胞中caspase-9的蛋白

13、表達量；MTT法及PI染色后流式細胞儀檢測細胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24 h后，R123熒光明顯增強，細胞胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達顯著減少，細胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，與正常對照組相比較均P<0.05；而5-HD作用24 h與正常對照組比較，上述指標(biāo)無明顯變化，P>0.05。②缺氧24 h后，結(jié)果與Diazoxide組相似，R123熒光明顯增強，細胞

14、胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達顯著減少，細胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，與正常對照組相比較均P<0.05；24小時缺氧合并Diazoxide組與缺氧組相比較，R123熒光明顯增強，細胞胞漿細胞色素C與線粒體細胞色素C的比值明顯降低，caspase-9的蛋白表達顯著減少，細胞呈明顯增殖增多、凋亡減少，P<0.05；而24小時缺氧合并5-HD組與缺氧組比較，R123熒光明顯降低，細胞胞漿細胞色素C

15、與線粒體細胞色素C的比值明顯升高，caspase-9的蛋白表達顯著增加，細胞呈明顯增殖減少、凋亡增多。
　　 結(jié)論：缺氧可以引起MitoKATP的開放以及 m的去極化，并進而抑制了細胞色素C從細胞線粒體釋放到細胞漿，抑制線粒體凋亡途徑。
　　 分題二 線粒體膜ATP敏感鉀通道對缺氧人肺動脈平滑肌細胞氧自由基的變化及細胞增殖中的作用
　　 目的：研究線粒體膜上ATP敏感鉀通道開放劑Diazoxide和線粒體膜電位在

16、缺氧影響人肺動脈平滑肌細胞細胞內(nèi)氧自由基的變化及細胞增殖中的作用，探索缺氧性肺動脈重建和肺動脈高壓形成的發(fā)生機制，為探索新的防治方法的提供試驗依據(jù)。
　　 方法：培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細胞(HPASMCs)，進行常氧或慢性缺氧培養(yǎng)。將標(biāo)本分為六組：①對照組；②MitoKATP阻斷劑5-HD組；③MitoKATP開放劑Diazoxide組；④慢性缺氧組；⑤慢性缺氧合并5-HD組；⑥慢性缺氧合并Diazoxide組。利用激光共焦顯微鏡(

17、Leica SP-1 USA)成像檢測線粒體膜電位，熒光染色檢測細胞內(nèi)氧自由基含量，免疫組化法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、C-fos及C-jun的表達和MTT法檢測細胞增殖情況。
　　 結(jié)果：①Diazoxide作用24h后，與正常對照組(R123熒光強度、細胞內(nèi)氧自由基含量、PCNA、C-fos、C-jun的蛋白的積光度值及MTT的A值。
　　 結(jié)論：Diazoxide能夠通過開放線粒體膜上ATP敏感的鉀通道，引起