西妥昔單抗誘導(dǎo)IGFIR活化介導(dǎo)胃癌細胞對西妥昔單抗耐藥.pdf

1、目的：
　　近年來，胃癌在全球男性人群中的病死率上升至第三位，女性中第五位，在發(fā)展中國家，胃癌的病死率接近2/3，中國胃癌的病死率達到42％。20-40％的患者手術(shù)后在2年內(nèi)復(fù)發(fā)。一旦復(fù)發(fā)目前無有效的治療方案，平均中位生存時間只有6個月。即使進行及時、規(guī)范的化療，中位生存時間仍然不足1年。因此，人們將注意力集中在如何將化療與有效的靶向藥物聯(lián)合。西妥昔單抗(Cetuximab C225)是一種抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體

2、，已經(jīng)與化療聯(lián)合廣泛應(yīng)用于K-ras、BRAF基因野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌及非小細胞肺癌。在胃癌治療方面，Ⅱ期臨床研究證明西妥昔單抗聯(lián)合多種以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案延長患者疾病進展時間，提高反應(yīng)率。但是最近一項大型多中心隨機Ⅲ期EXPAND臨床研究顯示:西妥昔單抗聯(lián)合順鉑和卡培他濱方案并不能明顯延長進展期胃癌患者無進展生存時間。因此，胃癌細胞可能對西妥昔單抗存在耐藥。
　　目前關(guān)于西妥昔單抗耐藥機制研究較多，其中替代性

3、通路的活化成為研究焦點。胰島素樣表皮生長因子受體-Ⅰ(ⅠGFIR)是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，在很多腫瘤特別是在胃癌中均過表達。配體與ⅠGFIR結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，進而活化多重信號通路，包括:Ras/Raf/MAPK（促絲裂原活化蛋白激酶）通路及PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-激酶）信號通路，這也是EGFR下游信號通路。因為與EGFR共用相同的信號通路，因此ⅠGFIR替代性活化可能引起西妥昔單抗耐藥。有研究表明，乳腺癌細胞中ⅠGFIR

4、過表達與曲妥珠單抗耐藥有相關(guān)性。另有研究發(fā)現(xiàn)在對西妥昔單抗耐藥的鼻咽癌細胞中存在ⅠGFIR過度活化。Chad等研究發(fā)現(xiàn)，將ⅠGFIR抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗作用于皮膚鱗癌細胞，可明顯增強西妥昔單抗敏感性。在胃癌細胞中，是否存在ⅠGFIR的活化，ⅠGFIR活化是否與耐藥有相關(guān)性，目前還未有相關(guān)報道。
　　本實驗以胃癌SGC7901和MGC803細胞為研究對象，明確胃癌細胞對西妥昔單抗敏感性，判斷西妥昔單抗耐藥是否與ⅠGFIR活化相關(guān)。進

5、而探討ⅠGFIR活化原因，活化后誘導(dǎo)耐藥的機制及逆轉(zhuǎn)耐藥方法，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、采用MTT法測定細胞活力。
　　2、采用集落形成實驗觀察細胞增殖能力。
　　3、采用Western blot檢測ⅠGFIR，Src，EGFR，Akt，ERK蛋白的表達。
　　4、采用Lipofectamine2000試劑進行瞬時轉(zhuǎn)染。
　　5、統(tǒng)計學(xué)處理:每次實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以(x

6、)±s表示，兩組間差異采用Student's t test分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果：
　　1、胃癌細胞對西妥昔單抗耐藥
　　通過基因檢測結(jié)果證實:胃癌SGC7901和MGC803細胞K-ras和BRAF基因呈野生型。
　　將0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細胞24 h、48 h和72 h，測定增殖抑制率。MTT

7、結(jié)果表明:西妥昔單抗作用于兩種胃癌細胞，增殖抑制率不足10％。將10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細胞14天，進行集落形成實驗。結(jié)果表明西妥昔單抗作用于胃癌細胞后，與對照組相比集落數(shù)量及大小無明顯變化。
　　Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細胞24 h、48h及72 h，從24 h開始EGFR磷酸化明顯減弱，ERK、Akt活性均有一定程度減弱。該結(jié)果證實

8、，西妥昔單抗在一定程度上封閉了EGFR通路。
　　2、西妥昔單抗可誘導(dǎo)胃癌細胞ⅠGFIR活化，ⅠGFIR活化參與西妥昔單抗耐藥
　　將10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細胞0.5h、2h、6h、16h及24 h，Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗作用于SGC7901細胞0.5h始，p-ⅠGFIR表達上調(diào)，6h表達程度最強，16h活化開始下降。MGC803細胞在西妥昔單抗作用2h始出現(xiàn)ⅠG

9、FIR活化增強，6h活化程度最強，16h時恢復(fù)至未加藥水平。
　　將ⅠGFIR抑制劑—OSI-906(10μM)與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨作用于胃癌SGC7901和MGC803細胞。Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗單藥作用于兩種胃癌細胞后，ⅠGFIR活化明顯增強，Akt活化有一定程度減弱，ERK活化明顯減弱;單藥OSI-906即可抑制Akt活化，對ERK活化程度無影響;西妥昔單抗聯(lián)合OSI-906后ⅠGF

10、IR活性被抑制，Akt活性被進一步抑制，兩藥聯(lián)合后對ERK抑制作用沒有進一步增強。本結(jié)果證明:應(yīng)用ⅠGFIR抑制劑，可抑制由西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化，同時Akt受ⅠGFIR調(diào)節(jié)影響更大，而ERK基本不受ⅠGFIR調(diào)節(jié)。MTT實驗及集落形成實驗證明:OSI-906可以增強胃癌細胞對西妥昔單抗的敏感性。
　　利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ⅠGFIR后，將西妥昔單抗作用于胃癌細胞，Western blot結(jié)果顯示:沉默ⅠGFIR后，與對照組

11、相比，西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化明顯降低，p-Akt表達下調(diào)。西妥昔單抗可很好的封閉ERK，沉默ⅠGFIR后對ERK活性影響不大。同時MTT結(jié)果證實:沉默ⅠGFIR后，胃癌細胞對西妥昔單抗敏感性增強。
　　3、Src參與西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化并與胃癌細胞西妥昔單抗耐藥相關(guān)
　　10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901及MGC803細胞，Western blot結(jié)果顯示:在SGC7901細胞中，0.5 h始

12、Src出現(xiàn)活化，隨時間延長活化程度增加，至16h達到頂點，后逐漸下降。在MGC803細胞中，0.5 h始Src出現(xiàn)活化，6h時達到最高點，隨著時間延長活化逐漸減弱。
　　將Src抑制劑PP2(10μM)與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨應(yīng)用于胃癌細胞后，Western blot結(jié)果顯示，西妥昔單抗單藥誘導(dǎo)兩種胃癌細胞在6h出現(xiàn)ⅠGFIR活化，聯(lián)合應(yīng)用PP2后，ⅠGFIR活化受到抑制。MTT實驗和集落形成實驗結(jié)果表明:聯(lián)合應(yīng)用

13、PP2后，胃癌細胞對西妥昔單抗敏感性增強。
　　應(yīng)用ⅠGFIR抑制劑OSI-906(10μM)或利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ⅠGFIR，與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨作用于胃癌SGC7901及MGC803細胞，Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗單藥作用2h、6h后可誘導(dǎo)胃癌細胞Src活化，而聯(lián)合OSI-906或沉默ⅠGFIR后，Src活化被抑制。
　　結(jié)論：
　　1、胃癌SGC7901及MGC803細胞對西