細菌鞭毛蛋白增加T84細胞單層通透性的作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　炎癥性?。↖nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種新興的全球性的疾病，其確切發(fā)病機制不明。最近研究顯示，腸道屏障的破壞與UC和CD有關。同時，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群涉及腸道炎癥的病理生理過程。細菌鞭毛蛋白(flagellin)是細菌鞭毛的主要組成成分，也是細菌重要毒性成分

2、，現(xiàn)有關鞭毛蛋白與腸道屏障關系的研究較少。
　　目的:
　　在Transwell細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)T84細胞單層(T84 monolayer)模擬腸上皮屏障，通過對細菌鞭毛蛋白處理前后極化T84細胞單層的跨上皮電阻(Transepithelial electric resistance，TER)及對大分子物質辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)流量的檢測，研究細菌鞭毛蛋白對T84細胞單層

3、通透性的影響，進而探討鞭毛蛋白與腸道屏障關系。
　　方法:
　　1.本實驗采用T84細胞單層。為了評估T84細胞單層轉運鞭毛蛋白及鞭毛蛋白對T84細胞單層通透性的影響，我們將細菌鞭毛蛋白及HRP加入到細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側中。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immune assay,ELISA)的方法檢測基底側樣本中的鞭毛蛋白、HRP。HRP流量及T84細胞單層TER作為評價T84細胞單層的通透性指標。人肥

4、大細胞系(Human mast cell line，HMC-1)來源于人肥大細胞白血病細胞，激活后具有肥大細胞特性，與T84細胞共培養(yǎng)于細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。
　　2.不同濃度細菌鞭毛蛋白加入細胞培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側與T84細胞共同孵育。2小時后測量TER及HRP流量來評價細菌鞭毛蛋白對腸上皮細胞系T84細胞單層的屏障功能的影響。
　　3.細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機分為正常對照組、鞭毛蛋白組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組及酮替芬干

5、預組并給予相應處理。共培養(yǎng)2小時后，測量各組TER及HRP流量。收集正常對照組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組和酮替芬干預組基底側細胞上清液用ELISA方法檢測組胺及類胰蛋白酶β2(Mast cell tryptase，MCT)，從而評價不同處理組對腸上皮細胞系T84細胞單層的屏障功能的影響。
　　4.為了觀察T84細胞攝取鞭毛蛋白，細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)T84細胞，把細菌鞭毛蛋白按不同劑量加入到細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，37℃孵育。2小時

6、后收集細胞培養(yǎng)板中T84細胞，用免疫細胞化學的方法檢測胞漿內(nèi)鞭毛蛋白。為了觀察T84細胞單層轉運鞭毛蛋白，將T84細胞培養(yǎng)在細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中，在腸腔側中加入鞭毛蛋白，2h后收集基底側中培養(yǎng)基，用ELISA方法檢測鞭毛蛋白。
　　5.所有實驗結果經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差描述，用Shapiro-Wilk檢驗方法進行正態(tài)性分析，Levene檢驗方法進行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析(On

7、e-wayANOVA)，對多組數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計學意義的再進行兩兩比較(LSD-t檢驗)。兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，相關性分析用Spearman秩相關。檢驗水準α=0.05，當P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.不同濃度鞭毛蛋白加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側，其相對TER(comparative TER)變化為:當鞭毛蛋白濃度小于8mg/L時，增加腸腔側鞭毛蛋白濃度，不引起上皮細胞跨膜電阻的下降。但當

8、鞭毛蛋白濃度大于8mg/L時，隨著鞭毛蛋白濃度增加，跨膜電阻逐漸下降，與正常對照組及小濃度鞭毛蛋白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=2536.68，P＜0.05)。不同濃度鞭毛蛋白加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側，HRP流量變化如下:當鞭毛蛋白濃度小于8mg/L時，增加腸腔側鞭毛蛋白濃度，不引起HRP流量的增加。但當鞭毛蛋白濃度大于8mg/L時，隨著鞭毛蛋白濃度增加，HRP流量逐漸增加，與正常對照組及小濃度鞭毛蛋白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=872

9、.05，P＜0.05)。
　　2.各組處理對腸上皮細胞系T84細胞單層的屏障功能影響結果比較:①正常對照組與HMC-1組TER和HRP流量較處理前無明顯變化，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。②鞭毛蛋白組comparativeTER值為（59.73±7.00）％較正常對照組明顯降低(P＜0.05)。同時鞭毛蛋白組的T84細胞單層HRP流量結果（0.08±0.01）％與正常對照組相比較有明顯差異(P＜0.05)。⑧鞭毛蛋白+

10、HMC-1組comparative TER值為（39.35±0.81）％，較鞭毛蛋白組降低(P＜0.05)。同時鞭毛蛋白+HMC-1組的T84細胞單層HRP流量結果（0.27±0.03）％與鞭毛蛋白組相比有明顯差異(P＜0.05)。④酮替芬干預組comparative TER值為(45.25±3.64)％，較鞭毛蛋白+HMC-1組明顯升高(P＜0.05)。同時酮替芬干預組的T84細胞單層HRP流量結果(0.19±0.04)％與鞭毛蛋白+

11、HMC-1組相比有明顯差異(P＜0.05)。
　　3.光學顯微鏡下觀察免疫細胞化學結果:鞭毛蛋白孵育過的T84細胞（鞭毛蛋白組）細胞質被染成棕褐色，而正常生長T84細胞(陰性對照組）細胞質為淡藍色。結果提示:鞭毛蛋白被T84細胞攝取至細胞質中。用ELISA方法檢測基底側鞭毛蛋白結果顯示:鞭毛蛋白組基底側鞭毛蛋白OD值明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且OD值均值大于1.5倍正常對照組OD值，即在基底側能檢測到鞭

12、毛蛋白。
　　4.對正常對照組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組、酮替芬干預組進行組胺及MCT檢測，發(fā)現(xiàn)各組組胺濃度及MCT水平差異有統(tǒng)計學意義。后經(jīng)組間兩兩比較，結果提示:無鞭毛蛋白刺激下，HMC-1不分泌或少量分泌組胺和MCT，在鞭毛蛋白刺激下，HMC-1分泌組胺及MCT增加。而酮替芬能抑制肥大細胞組胺及MCT的釋放。
　　5.HRP流量與組胺濃度、MCT水平的相關性分析結果:組胺濃度與HRP流量之間r=0.86，P