山茱萸活性成分5-羥甲基糠醛對H2O2誘導損傷的大鼠海馬神經元保護作用的研究.pdf

1、目的：當前，伴隨著我國人口老齡化問題的急劇加重，一些神經系統(tǒng)退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)的發(fā)病率日益增加。這些疾病不僅嚴重威脅著老年人口的生命健康，而且極大地增加了社會負擔。在此類疾病的治療上，中西醫(yī)結合的方法目前越來越顯示出其優(yōu)越性。中醫(yī)學認為，中樞神經系統(tǒng)損傷的發(fā)生，病機雖較復雜，但歸納起來不外乎內因和外因兩方面，而且內外因在一定條件下相互影響、相互作用。中醫(yī)結合現(xiàn)代研究成果認為，中樞神經系統(tǒng)疾病病位雖在腦髓

2、，但是由于臟腑經絡、陰陽氣血失調所致。對中樞神經系統(tǒng)疾病，中醫(yī)的治療原則是遵循整體觀念與辨證論治宗旨，根據(jù)“急則治其標、緩則治其本”及“異病同治、同病異治”的原則，與西醫(yī)治療相結合，貫穿于中樞神經系統(tǒng)疾病神經修復的全過程。“肝腎與腦相關”的認識由來已久。腎主骨生髓，輸精髓以充盈腦海，為腦活動提供了物質基礎;“腎藏精、精生髓、髓充腦、腦主元神”。腎腦結構上相互聯(lián)屬，從經絡結構上，腦與腎在體表通過督脈和足太陽膀胱經相互溝通，在里腎主骨生髓，

3、髓充為腦，通過骨、髓發(fā)生聯(lián)系。腦與腎是腦與臟腑間關系最為密切的一對。經絡結構上所形成的“腦—督脈—腎”子午線，是人體生命活動的根本，故又稱為“生命線”。由此可見，中醫(yī)理論歷來有“肝腎與腦相關”的認識。山茱萸作為補益肝腎的代表中藥，在臨床有著較好的療效，我國自古就有山茱萸應用于糖尿病（中醫(yī)稱為“消渴癥”）治療的記載?，F(xiàn)代藥理學研究表明，山茱萸屬植物中含有揮發(fā)性成分、環(huán)烯醚萜類成分、鞣質和黃酮等4大類成分，還含有大量的小分子化合物和有機酸，

4、5-羥甲基糠醛(5-Hydroxy-methylfurfural，5-HMF)即為其中一種。通過前期研究（“山茱萸炮制機理研究”，國家科技部“十五”攻關課題2001BA701A11），明確了山茱萸酒蒸后藥效增強，其中補益肝腎作用更加明顯，山茱萸制品總提液石油醚萃取部位、醇沉多糖部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位等為山茱萸炮制增效的活性部位，初步了解了這幾個溶劑萃取部位的化學成分，明確山茱萸炮制前后沒食子酸、維生素E、5-羥甲基糠醛等

5、含量明顯增加。近年來的研究表明:5-羥甲基糠醛具有增強大鼠紅細胞變形活性及抗氧化、改變血液流變學等對人體有益的作用。對由H2O2和葡萄糖所致?lián)p傷后的血管內皮細胞具有保護作用，可逆轉SOD活力減低，推測抗氧化作用可能是其保護血管內皮細胞的機制之一。因此，本研究在前期課題“山茱萸炮制機理研究”和“山茱萸活性部位、成分對衰老及相關模型影響的研究”(國家自然科學基金，30772851)的基礎上，基于中醫(yī)“腎腦相關”的理論基礎，開展對我國滋陰補腎

6、經典藥材山茱萸的活性成分——5-羥甲基糠醛（5-HMF）對神經細胞的保護作用及機理研究。此研究對闡明5-HMF的藥理作用，特別是其存在或產生對中藥及其復方療效的影響有一定的意義。
　　方法：采用大、中、小三個不同劑量的山茱萸水煎液灌胃家兔，通過抽提灌胃后家兔的腦脊液，分別運用HPLC和UPLC—MS兩種方法，來檢測家兔腦脊液中5-HMF的含量。透射電鏡下觀察空白對照組、H2O2模型組和加藥組(大、中、小三個劑量5-HMF)的海馬細

7、胞形態(tài)并拍照。MTT實驗檢測空白對照組、H2O2模型組和加藥組的細胞活力。利用2，4-二硝基苯肼反應和黃嘌呤氧化酶法分別檢測空白對照組、模型組和加藥組內LDH、SOD的變化，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。Real time-PCR對bcl-2、p53、Bax和caspase-3等與凋亡相關的基因mRNA表達水平進行檢測，Western blot對bcl-2、p53、Bax和caspase-3等基因蛋白表達水平進行檢測。
　　結果：

8、通過HPLC，在山茱萸水煎液大劑量組灌胃后所取家兔腦脊液中能檢測出5-HMF，而中、小劑量組灌胃后所取家兔腦脊液未能檢測出5-HMF。而運用UPLC—MS分析，結果發(fā)現(xiàn)大、中、小三個劑量組的腦脊液中都能檢測到5-羥甲基糠醛。電鏡下，空白對照組神經元細胞核形態(tài)正常，核膜完整，染色質分布均勻;神經元內多數(shù)線粒體正常。模型組可見細胞核明顯固縮，核膜不完整，胞質內有大量空泡;神經元內線粒體腫脹，嵴斷裂變化明顯。5-HMF大劑量組（終濃度10um

9、ol/L）可見胞質內有少量空泡，核膜基本完整;神經元內部分線粒體腫脹。而5-HMF中、小劑量組電鏡下未見明顯改變。MTT實驗結果表明，H2O2可引起模型組海馬神經細胞活性降低，與空白對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，而5-HMF大劑量組、中劑量組可抑制過氧化氫損傷引起的活性降低(P＜0.05)，5-HMF小劑量組與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)。LDH、SOD檢測結果表明，模型組細胞LDH活性比空白對照組有明顯升高(P＜0.

10、01)，而5-HMF大、中劑量組使得H2O2誘導損傷的細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯下降(P＜0.01);模型組細胞SOD活性比空白對照組有明顯下降(P＜0.05)，而5-HMF大、中劑量組使得H2O2誘導損傷的細胞培養(yǎng)液中SOD活性顯著升高(P＜0.01)。流式細胞儀檢測結果顯示，模型組細胞凋亡率比空白對照組有明顯升高，而5-羥甲基糠醛大、中劑量組對H2O2損傷的海馬神經細胞的凋亡率有明顯的抑制作用，也反映了一定程度的保護作用。Realt

11、ime-PCR實驗結果顯示，caspase-3模型組與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)，bax，p53，和bcl-2模型組與空白對照組相比，差異極顯著(P＜0.01);5-HMF大劑量組作用后，bax，p53，和bcl-2與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)，而caspase-3與模型組相比，無顯著差異;5-HMF中劑量組作用后，bax和bcl-2與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)，p53與模型組相比，有顯著性差異

12、(P＜0.05)，而caspase-3與模型組相比，無顯著差異。Western Blot實驗結果顯示，bax，p53，bcl-2和caspase-3模型組與空白對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05);5-HMF大、中劑量組(10uM、1uM)作用后，bax，p53，bcl-2和caspase-3的蛋白表達水平與模型組(model)相比，差異極顯著(P＜0.01)。
　　結論：根據(jù)上述實驗結果，我們得出如下結論:①5-羥甲基糠醛能