TNFR在下咽鱗狀細胞癌中的表達及利用基因開關調控TNFR表達對下咽癌化療、TNF治療的增敏作用.pdf

1、下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)惡性度較高，鄰近擴散、淋巴結轉移都較早。下咽癌的病理分型以下咽鱗狀細胞癌（hypopharyngealsquamous cell carcinoma，HPSCC）最多見。因為發(fā)病部位隱蔽，下咽癌很難早期發(fā)現(xiàn)，且易沿粘膜下擴散，臨床發(fā)現(xiàn)的時候很多已經(jīng)達到中晚期，能夠接受手術的病例非常有限，大約只在60％左右，五年生存率大約為20％-40％。盡管現(xiàn)代醫(yī)學飛速發(fā)展，診療設備、外科手術和

2、放化療等綜合診療手段在不斷改進，但在最近的二十余年里HPSCC的五年生存率并沒有明顯的改善和提高。開發(fā)和應用更加有效的腫瘤治療手段，尋求更加有效的治療策略對提高HPSCC的治療水平至關重要。
　　已經(jīng)證實在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，分子生物學機制發(fā)揮著至關重要的作用，因而越來越多的學者關注于基因治療，試圖從腫瘤的發(fā)生根源尋找遏制腫瘤的方法。人們理想的基因治療是可以根據(jù)疾病的嚴重程度來調節(jié)治療基因在特定器官內的表達水平。但是在基因治療領

3、域如何對特定基因定時、定量地調控并研究其不同表達水平下的作用是一個難題。依賴于熱休克蛋白、激素或重金屬等的傳統(tǒng)基因表達誘導系統(tǒng)，存在著高本底、多嗜效應和環(huán)境污染等缺陷，限制了其應用和發(fā)展。Gossen等創(chuàng)建的基因開關系統(tǒng)，又稱為四環(huán)素誘導表達開關系統(tǒng)（Tet-on/off系統(tǒng)）克服了傳統(tǒng)誘導系統(tǒng)的不足。這種系統(tǒng)是通過原核大腸桿菌Tnol轉座子調控元件，在真核細胞中定量并特異地控制外源基因表達的體系。該系統(tǒng)被認為是目前最理想的真核生物基因

4、表達系統(tǒng)，具有高效、特異、嚴密等特點，在基因功能和治療等領域已被國內、外學者廣泛地應用。但是，尚未有HPSCC方面的相關研究報道。
　　TNF-α(tumor necrosis factor-α，以下簡稱TNF)于30年前被發(fā)現(xiàn)，是到目前為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強的細胞因子，對多種腫瘤細胞具有選擇性的細胞毒作用。TNF既能直接殺死腫瘤細胞，又能通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。它的最顯著的活性特征是可以在體內外特異的殺傷腫瘤細胞，而對

5、正常細胞無明顯的毒性作用。但是，由于TNF在體內的半衰期較短，低劑量的應用抗腫瘤效果不太顯著，甚至在某些腫瘤，還有促進腫瘤細胞增殖的作用，要達到療效水平，需持續(xù)大劑量注射，這通常會引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、頭痛、休克等全身癥狀，臨床應用的效果不太理想，大大限制了TNF的使用范圍。
　　TNF主要通過與兩個受體:TNF受體1（tumor necrosis factor receptor1，TNFR1）和TNF受體2(tumor necr

6、osis factor receptor2，TNFR2)結合來發(fā)揮生物學作用。這兩類受體均由信號肽、胞漿結構區(qū)、跨膜結構區(qū)和胞外結構區(qū)組成。兩類受體的胞外區(qū)同源性為28％，胞內區(qū)沒有同源性，提示兩類受體介導的是不同的信號傳遞通路。TNFR1可產(chǎn)生兩種相反的作用效應，它既可誘導產(chǎn)生TNF的毒性效應，促進細胞凋亡、壞死，又可以通過激活NF-κB促進增殖。TNFR2也具有兩種作用途徑，它既可以增強TNFR1引起的凋亡，又可獨立誘導凋亡，還可以

7、促進增殖。兩種受體在什么情況下選擇哪種通路，仍不完全清楚。有研究表明在細胞表面TNFR的表達水平變化可以改變細胞對TNF的敏感性，細胞表面的TNFR數(shù)目越高，對TNF的細胞毒性作用就越敏感，而對TNF作用不敏感的腫瘤細胞，細胞表面的TNF受體缺如或幾乎觀察不到，受體數(shù)目與腫瘤細胞敏感性呈正相關?？梢姡琓NFR對機體的TNF作用具有重要的調節(jié)作用。
　　TNF與多種化療藥物具有協(xié)同作用。經(jīng)研究表明TNF與化療藥物聯(lián)合應用可明顯增強軟

8、組織肉瘤、黑色素瘤、胃癌、肺癌等多種腫瘤的化療效果。但是尚未有相關的研究在頭頸部腫瘤中開展。并且，TNF與化療藥物協(xié)同作用的機理及調控機制未完全清楚。不管其確切的機制如何，在下咽癌的治療過程中，如何提高腫瘤的殺傷作用并同時減少TNF和化療藥物的用量，是腫瘤治療的核心問題。腫瘤細胞的TNFR表達水平對這一協(xié)同作用可能具有重要影響，與其相關的研究可能具有重要意義。
　　本研究用免疫組化和Western blot的方法檢測TNFR1和T

9、NFR2在HPSCC組織中的表達，分析TNFR表達與HPSCC臨床病理因素的關系。通過慢病毒構建利用基因開關系統(tǒng)穩(wěn)定高表達人TNFR2基因的下咽癌FaDu細胞系。研究TNF、順鉑（cisplatin，DDP）及二者聯(lián)合作用對TNFR正常表達的下咽癌FaDu細胞增殖、凋亡的影響。觀察當用中和抗體阻斷TNFR1的作用、利用基因開關系統(tǒng)高表達TNFR2后、以及同時阻斷TNFR1作用、高表達TNFR2后，TNF、DDP作用后，細胞系增殖、凋亡情

10、況的變化，分析TNFR表達變化與TNF、DDP敏感性的關系，探討下咽癌的TNF、DDP治療抵抗與TNFR表達水平之間的關系，為臨床減少化療藥物的用量，提高下咽癌的治療水平提供理論基礎和依據(jù)。研究分為三部分:
　　第一部分 TNFR在下咽鱗狀細胞癌中的表達及與臨床病理因素的關系目的:檢測TNFR1和TNFR2在HPSCC組織中的表達，并且與臨床諸病理因素進行相關分析，探討TNFR的表達與HPSCC發(fā)生、發(fā)展的關系。
　　方法:

11、
　　1用免疫組織化學SP染色的方法檢測45例HPSCC組織及配對癌旁下咽粘膜組織中TNFR1和TNFR2的表達，并與臨床病理因素進行分析。
　　2 Western blot檢測3例HPSCC患者癌組織和癌旁下咽粘膜組織中TNFR1及TNFR2的表達。
　　結果:
　　1免疫組織化學染色結果1.1 TNFR在HPSCC組織及癌旁組織中的表達:45例HPSCC癌組織中，TNFR1和TNFR2的陽性表達率均為100％

12、。TNFR1在癌旁粘膜組織中的表達率為50％，TNFR2在癌旁下咽粘膜組織中的表達率為10％。與癌旁下咽粘膜組織比較，TNFR1與TNFR2在HPSCC癌組織中的陽性表達率均明顯升高(P＜0.01)，表達水平也顯著高于癌旁下咽粘膜組織(P＜0.01)1.2 TNFR與HPSCC臨床病理因素的關系:
　　在45例HPSCC病人中，TNFR1和TNFR2的AOD在60歲以下組和60歲以上組的差異經(jīng)統(tǒng)計學分析無明顯差異（TNFR1:t=

13、0.125，P=0.901; TNFR2:t=0.149，P=0.883）。在37例男性病人和8例女性病人中，TNFR1和TNFR2的表達與性別無差異（TNFR1: t=0.060，P=0.952;TNFR2:t=0.959，P=0.343）。45例HPSCC中，30例為梨狀窩型，10例環(huán)后區(qū)型，5例為下咽后壁區(qū)，TNFR1和TNFR2的表達在三種分型中的表達無統(tǒng)計學差異（TNFR1:F=0.169，P=0.845;TNFR2:F=1.

14、888，P=0.164)。
　　TNFR1在13例高分化鱗癌中的AOD為0.192±0.051，在32例低分化鱗癌中的表達為0.239±0.029，兩者之間有顯著差異(t=3.822，P＜0.01);TNFR1在T3-T4表達的AOD為0.239±0.030，明顯高于其在T1-T2期的表達(AOD為0.178±0.044)兩者之間有顯著性差異(t=5.087，P＜0.01);TNFR1在臨床分期Ⅲ-Ⅳ級的AOD為0.241±0.0

15、29，表達高于Ⅱ期的AOD為0.187±0.045，兩者之間有顯著統(tǒng)計學差異（t=4.751，P＜0.01）;TNFR1在淋巴結轉移的病例中的表達0.241±0.030明顯高于無淋巴結轉移組0.194±0.046，差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.189，P＜0.01)。TNFR1在HPSCC癌組織中的表達與腫瘤的分化程度、腫瘤的T分期、臨床分期、淋巴結轉移密切相關，而與性別、年齡、分型無關(P＞0.05)。
　　TNFR2在高分化鱗癌

16、13例中AOD為0.226±0.055，在32例低分化鱗癌中的表達為0.205±0.040，在10例T1-2分期組織中表達的AOD為0.227±0.061，在T3-4期AOD為0.206±0.040，在臨床分期為Ⅱ期的AOD為0.221±0.057，Ⅲ-Ⅳ0.207±0.040，在30例淋巴結轉移的組織中表達的AOD為0.202±0.036，在15例無淋巴結轉移的AOD為0.229±0.056。經(jīng)統(tǒng)計學分析，TNFR2的表達與HPSCC

17、患者的年齡、性別、腫瘤的生長部位、分化等級、臨床分期、T分期均無相關性（P均＞0.05）。
　　2 TNFR1與TNFR2的相關性分析TNFR1和TNFR2的表達經(jīng)統(tǒng)計學分析呈負相關(rs=-0.305)，TNFR1與TNFR2的AOD比值與HPSCC的分化程度、T分期、臨床分期、淋巴結轉移密切相關，而與性別、年齡、分型無關（P均＞0.05）。TNFR1與TNFR2在HPSCC的發(fā)生、發(fā)展中存在一定的相互調節(jié)作用，其確切機制有待我

18、們進一步研究。
　　3 Western blot結果:
　　TNFR1在3例HPSCC癌組織中的表達為0.822±0.144，在3例癌旁下咽粘膜組織表達為0.080±0.104，TNFR1在癌組織中的表達明顯高于在癌旁下咽粘膜組織的表達，兩者之間有統(tǒng)計學差異(t=5.079，P＜0.05)。TNFR2在3例HPSCC癌組織中的表達為0.775±0.072，在3例癌旁粘膜組織中的表達為0.010±0.005，TNFR2在HPS

19、CC癌組織中的表達顯著高于癌旁粘膜組織中的表達，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者之間有顯著差異(t=17.333, P＜0.01)。
　　結論:TNFR1和TNFR2在HPSCC癌組織中的表達較癌旁下咽粘膜組織均明顯升高。TNFR1的表達水平與腫瘤的病理分化程度、腫瘤T分期、臨床分期和淋巴結轉移密切相關;TNFR2的表達與腫瘤的臨床病理因素無顯著關系;TNFR1與TNFR2的表達呈負相關，兩者的比值與HPSCC的臨床病理因素呈正相關，說明TNF

20、R1和TNFR2之間存在著一定的負調節(jié)關系。TNFR在HPSCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　第二部分慢病毒介導的利用基因開關穩(wěn)定高表達人TNFR2基因的下咽癌FaDu細胞系的建立目的:構建慢病毒介導的利用基因開關系統(tǒng)穩(wěn)定高表達人TNFR2基因的下咽癌FaDu細胞系，為后續(xù)研究調控TNFR表達對TNF、DDP作用的影響提供細胞模型。
　　方法:
　　1 Tet-on-Puro-TNFR2慢病毒載體的構建TNFR

21、2基因序列調取引物由上海桑尼生物合成，TNFR2原始ORF（open reading frame，ORF）購自漢恒生物科技（上海）有限公司，PCR擴增TNFR2ORF序列，并將PCR產(chǎn)物與Tet-on系列慢病毒載體pHBTet-on-Puro同步XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收。將酶切的PCR產(chǎn)物與載體連接過夜后轉化感受態(tài)細胞，轉化后的TNFR2平板挑菌，菌液進行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送上海桑尼生物技術有限公司測序。
　　2構

22、建質粒的包裝前準備2.1慢病毒系統(tǒng)構成:三質粒Tet-on慢病毒系統(tǒng)包括慢病毒質粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（對照為pHBTet-on-Puro空質粒，該Tet-on慢病毒系統(tǒng)購自上海漢恒生物科技有限公司），包裝輔助質粒:pspax2、pMD2G，其中pHBTet-on-Puro-TNFR2具有Puromycin藥物抗性，可以進行藥物篩選;同時帶有藥物誘導下啟動子UBC，可以通過強力霉素(Doxorubicin，Dox)誘

23、導目的基因TNFR2的表達。
　　2.2慢病毒載體高純度制備:將制備的慢病毒質粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（對照為pHBTet-on-Puro空質粒）及其輔助包裝原件載體質粒pspax2、pMD2G，分別進行高純度無內毒素抽提，制備出高純度的慢病毒質粒及包裝輔助質粒。
　　3慢病毒包裝
　　用LipoFiterTM脂質體介導慢病毒載體pHBTet-on-Puro-TNFR2（對照為pHBTet-on-Pu

24、ro空質粒）與pspax2，pMD2G共轉染293T細胞，進行慢病毒包裝。72小時后收取病毒上清并進行超速離心濃縮，用500ulDMEM重懸慢病毒顆粒。
　　4穩(wěn)定可調控表達TNFR2基因FaDu細胞系的構建將濃縮的慢病毒顆粒感染人下咽癌FaDu細胞，嘌呤霉素篩選一周，得到穩(wěn)定可調控表達TNFR2基因的下咽癌FaDu細胞。進一步擴增細胞并進行傳代，保種，擴增及下一步檢測實驗。
　　5 Tet-on調控TNFR2基因的穩(wěn)定轉染

25、FaDu細胞系的驗證擴增后一部分細胞用于保種，一部分細胞加入2ug/ml的Doxorudicin誘導24小時之后，收集細胞蛋白，實時定量PCR和Western Blot檢測轉染前后FaDu細胞中TNFR2的mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1將質粒轉化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆擴增后提取質粒，經(jīng)測序分析，結果與實驗設計一致。
　　2用最優(yōu)篩選濃度為2.0μg/ml的嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達Tet-on系統(tǒng)的FaDu細

26、胞克隆。
　　3經(jīng)實時定量PCR檢測穩(wěn)定表達Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu細胞與對照組在加入Dox誘導24小時后比較，TNFR2的mRNA水平明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　4 Western blot法檢測穩(wěn)定表達Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu細胞與對照組在加入Dox誘導24小時后比較，TNFR2的蛋白水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結論

27、:利用慢病毒載體成功構建利用Tet-on系統(tǒng)穩(wěn)定高表達人TNFR2基因的下咽癌FaDu細胞系，為后續(xù)研究該基因的功能提供細胞模型。
　　第三部分利用基因開關調控TNFR表達對下咽癌化療、TNF治療的增敏作用目的:觀察在TNFR1和TNFR2正常表達的Fadu細胞，TNF和DDP對細胞增殖、凋亡的影響;在TNFR1正常作用，TNFR2高表達的Fadu細胞，TNF和順鉑對細胞增殖、凋亡的影響變化;以及在TNFR1作用被阻斷后，TNF和

28、DDP對細胞增殖、凋亡的影響變化;最后觀察阻斷TNFR1作用聯(lián)合TNFR2高表達情況下，TNF和DDP對Fadu細胞增殖、凋亡的影響變化，分析TNFR1和TNFR2表達的變化對TNF和DDP作用敏感性的影響。
　　方法:
　　本部分主要研究人為調控TNFR1和TNFR2表達變化時，TNF、DDP以及二者聯(lián)合作用情況下，F(xiàn)adu細胞增殖、凋亡情況的變化。利用MTT法檢測Fadu細胞的增殖抑制作用;流式細胞Annexin V/P

29、I雙染色法檢測細胞凋亡情況。
　　1研究TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對TNFR正常作用的Fadu細胞增殖、凋亡的影響。
　　2研究利用中和抗體阻斷TNFR1作用后，TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對Fadu細胞增殖、凋亡情況的影響變化。
　　3研究在TNFR1正常作用，TNFR2高表達后，TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對Fadu細胞系增殖、凋亡情況的影響變化。
　　4研究高表達TNFR2聯(lián)合阻斷TNFR1作用后，

30、TNF、DDP以及兩者聯(lián)合作用對Fadu細胞系增殖、凋亡情況的影響變化。
　　結果:
　　1 MTT檢測結果1.1穩(wěn)定表達Tet-on-Puro的Fadu細胞系（A組），TNF在低濃度(0.1，1，10 ng/ml)時對Fadu細胞有促增殖作用，而高濃度（50-100 ng/ml）具有抑制腫瘤生長的作用。Fadu細胞系對DDP作用抵抗，6μg/ml的DDP作用24h后，腫瘤細胞存活率為81.8％。TNF在低濃度與DDP聯(lián)合應

31、用即可明顯增強DDP的抗腫瘤效果。
　　1.2穩(wěn)定表達Tet-on-Puro的Fadu細胞系，利用中和抗體阻斷TNFR1作用后（B組），可逆轉小劑量TNF(0.1-10 ng/ml)的促增殖作用(t=4.390，t=5.886，t=5.258，P均＜0.05)，并且低濃度與DDP聯(lián)合作用對腫瘤的抑制作用較A組增強，高劑量（50-100 ng/ml）TNF單獨或聯(lián)合DDP應用，均與A組無顯著差異（P均＞0.05）。
　　1.3

32、穩(wěn)定表達Tet-on-Puro-TNFR2的Fadu細胞系，Dox誘導TNFR2高表達（C組）后與A組相比，小劑量（0.1，1，10ng/ml）即對細胞具有增殖抑制作用，具有顯著差異（P均＜0.01），高濃度（50-100 ng/ml）的TNF作用無差異（P均＞0.05）。Dox誘導后，可提高各濃度TNF與DDP聯(lián)合應用的抗腫瘤效果，與A組相比，有統(tǒng)計學差異（P均＜0.05）。
　　1.4穩(wěn)定表達Tet-on-Puro-TNFR2

33、的Fadu細胞系，同時高表達TNFR2和中和TNFR1作用（D組），與A組相比，TNF各濃度對Fadu細胞均有明顯的增殖抑制作用（P均＜0.05）;與B、C組相比，除TNF濃度為0.1ng/ml無差異，其他濃度均有更明顯的增殖抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05);TNF和DDP聯(lián)合作用于D組細胞后，與A、B組相比，各濃度對Fadu細胞的增殖抑制作用均明顯加強（P均＜0.05）;與C組相比，在TNF低濃度（0.1，1，10ng/m

34、l）時聯(lián)合DDP具有明顯抑制作用，高濃度（50-100 ng/ml）無顯著差異。
　　2流式細胞術Annexin V/PI雙染色法檢測TNF、TNF聯(lián)合DDP對各實驗組FaDu細胞凋亡率的影響2.1在10ng/ml的TNF作用下，B組與A組的凋亡率無顯著差異(t=0.918，P=0.456)，C組比A組凋亡率明顯增高(t=13.504，P＜0.01)。D組與A、B組相比凋亡率明顯升高，具有統(tǒng)計學差異(t=12.424，t=10.0

35、58，P＜0.05);與C組相比，凋亡率無明顯變化（t=0.624，P＞0.05）
　　2.210ng/ml的TNF和6μg/ml的DDP共同作用后，B組與A組凋亡率無顯著差異;C組比A組凋亡率明顯增高(t=8.498，P＜0.05);D組與A組、B組相比，凋亡率明顯升高(t=4.606，t=4.737，P＜0.05);與C組相比，凋亡率無明顯變化(t=0.795，P＞0.05)結論:
　　1在TNFR正常表達的下咽癌Fad

36、u細胞系，TNF在低濃度（0.1-10ng/ml）時對Fadu細胞有促增殖作用，而高濃度（50-100ng/ml）具有抑制腫瘤生長的作用。TNF在低濃度與DDP聯(lián)合應用即可明顯增強DDP的抗腫瘤效果。
　　2在下咽癌Fadu細胞系中和TNFR1作用后，可逆轉低濃度TNF的促腫瘤增殖作用，并且可增強低濃度TNF與DDP聯(lián)合應用的抗腫瘤效果。
　　3在下咽癌Fadu細胞系中，TNFR2的表達增高可增強低濃度TNF和各濃度TNF聯(lián)