胡椒堿對大鼠急性脊髓損傷后神經保護作用的量效關系及作用機理研究.pdf

1、背景:脊髓損傷是神經系統(tǒng)常見疾病之一。因其病理過程復雜，雖經國內外學者多年的研究，仍缺乏有效的治療方法，仍是醫(yī)學界難題。依據對脊髓損傷后病理生理過程的新認識和胡椒堿(Piperine)的藥理作用，以及我們先前的研究顯示:胡椒堿對脊髓損傷大鼠動物模型具有保護作用，但缺乏大鼠脊髓損傷后神經功能恢復是否與胡椒堿存在量效關系的數(shù)據。因此，設計本研究以觀察胡椒堿對脊髓損傷后神經功能的保護作用的量效關系，并對其可能的作用機制做進一步的探討，為臨床開

2、發(fā)新藥提供理論基礎。
　　 第一部分，胡椒堿對大鼠脊髓損傷后肢功能恢復的量效關系觀察
　　 目的:
　　 觀察胡椒堿對大鼠急性脊髓損傷后肢功能的恢復與胡椒堿的劑量關系
　　 方法:
　　 (1)動物來源與分組:將72只成年雄性Wistar大鼠（體重250g-320g）應用隨機數(shù)字表進行隨機分組，分別為假手術組、胡椒堿溶媒組、胡椒堿1組（25mg/kg）、胡椒堿2組(50mg/kg)、胡椒堿3組(7

3、5mg/kg)、胡椒堿4組(100mg/kg)、胡椒堿5組(125mg/kg)、胡椒堿6組(150mg/kg)，共8組，設編號分別為A，B，C，D，E，F(xiàn),G,H，每組9只大鼠。
　　 (2)動物模型的制作:所有大鼠在胸10水平后入路椎板切除開窗，暴露硬膜囊，假手術組只打開椎板，不撞擊脊髓，其余各組均以改良Allen's法以10g×5cm力撞擊脊髓，制造急性脊髓損傷模型。
　　 (3)給藥方式:造模成功后，假手術組大鼠給

4、予7ml/kg生理鹽水灌胃給藥，胡椒堿溶媒組大鼠只給予7ml/kg胡椒堿溶媒灌胃給藥，胡椒堿組大鼠按實驗分組要求給予胡椒堿懸濁液（含7ml/kg胡椒堿溶媒）灌胃給藥。每組大鼠都是在術后1d給予灌胃給藥，每天一次。
　　 (4)大鼠脊髓神經功能測定:術后采用國際通用的BBB行為學評分法(Basso-Beattie-BresnahanTest)進行評價后肢功能，術后1d評分為0分則納入實驗，表示造模成功，若不是則剔除，剔除的數(shù)量再造

5、模補充，于術后3d、7d和14d進行評分，其評分結果作為實驗數(shù)據。
　　 (5)數(shù)據統(tǒng)計:本實驗的數(shù)據應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，若符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，否則用中位數(shù)表示。多個樣本均數(shù)比較，若數(shù)據符合正態(tài)性分布且方差齊則采用one-wayANOVA(F檢驗)，組間兩兩比較采用SNK-q法或Dunnet-t法檢驗，否則采用秩轉換的非參數(shù)檢驗的Mann-WhitneyU法。定P＜0.05為有顯著性差異

6、。
　　 結果:
　　 1、根據BBB評分標準，術后1d，除A組沒有截癱外，其他各組均出現(xiàn)癱瘓，評分為0分。術后3d、7d和14d，A組（假手術組）術后無截癱，評分均為21分;隨時間增加B組大鼠后肢功能有所恢復，BBB評分分別是（1.444±0.527，2.333±0.500，7.111±1.054）。其余各組中，相同時間，隨著胡椒堿劑量的增加BBB評分值增加，C組BBB評分分別是（2.000±0.707，3.000±0

7、.707，7.778±1.201），D組BBB評分分別是(3.333±0.866，4.111±0.781，9.889±0.781)，E組BBB評分分別是（4.778±0.667，6.111±1.269，11.778±1.201），F(xiàn)組BBB評分分別是（6.000±0.707，8.111±0.781，13.778±0.971），G組BBB評分分別是(6.444±0.881，8.777±0.666，14.333±0.707)，F(xiàn)組BB評分分

8、別是(7.000±1.118，9.555±1.013,15.111±0.781)。
　　 2、術后3d、7d、14d，A組與各組比較均有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P＜0.05）。B組（溶媒組）與各劑量組的比組較中發(fā)現(xiàn)，小劑量時無明顯作用，大劑量時其作用變化不明顯。術后3d、7d、14d，C組(25mg/kg)與B組（溶媒組）比較(p=0.706,P=0.435,P=0.980，P＞0.05)差異不明顯。當劑量大于50mg/kg

9、時，隨著胡椒堿劑量增加差異逐漸明顯，B、C、D、E、F組相互比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而劑量大于125mg/kg時隨著胡椒堿劑量的增加，其作用效果變化不明顯，F(xiàn)組(100mg/kg)與G組(125mg/kg)(P=0.988,P=0.669，P=0.952,P＞0.05)，G組(125mg/kg)與H組(150mg/kg)(P=0.989,P=0.684,P=0.490,P＞0.05),F組(100mg/kg)與H組(150m

10、g/kg)(P=0.463,P=0.069,P=0.096,P＞0.05)比較，無統(tǒng)計學意義。相同時間，B組與C組、D組、E組比較及其相互比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明胡椒堿的用量存在最適劑量范圍。
　　 3、根據本實驗觀察，隨著給藥劑量的增加，大鼠后肢功能恢復力提高，但是藥物的毒性亦增加，在本實驗中表現(xiàn)為大鼠生存時間縮短，當胡椒堿劑量大于125mg/kg時，劑量越大，生存時間越短。綜合效應與毒性，胡椒堿促進脊髓損傷恢

11、復的最適濃度為50～100mg/kg。
　　 結論:
　　 (1)經胃灌注一定劑量的胡椒堿對大鼠脊髓損傷后神經功能的恢復具有促進作用，且這種效應與胡椒堿的用量在一定程度上呈劑量依賴關系。
　　 (2)超大劑量的胡椒堿具有毒性作用，胡椒堿促進脊髓損傷的最適濃度為50～100mg/kg。
　　 第二部分，胡椒堿對大鼠脊髓損傷后神經功能保護的作用機制研究
　　 目的:
　　 進一步探討胡椒堿對大

12、鼠急性脊髓損傷后神經功能保護的作用機制
　　 方法:
　　 (1)取成年雄性Wistar大鼠(體重250g-320g)48只，分組方法同實驗第一部分，但是每組6只大鼠。動物模型的制作、給藥方式和數(shù)據統(tǒng)計同第一部分。各組于術后3d、7d時各分別隨機取3只處死、取材，留取脊髓損傷部位長約5mm的脊髓組織作為病理標本，用4％多聚甲醛液固定48小時，常規(guī)石蠟包埋，4℃保存，備用。
　　 (2)術后3d、7d、14d的脊髓

13、標本均進行常規(guī)HE染色觀察其病理變化，用免疫組化檢測炎性細胞因子TNF-α、IL-6的含量變化。
　　 結果:
　　 1、脊髓病理HE染色結果
　　 術后3d，A組（假手術組）脊髓組織完整，細胞排列整齊，未見明顯壞死及空洞，脊髓灰白質界限清楚、神經元及髓鞘結構正常，神經元細胞形態(tài)好，數(shù)量多，胞膜完整。而其他組均有不同程度的變化，從局部片狀出血壞死、周圍炎性細胞的浸潤、神經元胞體的萎縮、膠質細胞的反應性增生、白質呈

14、網狀脫髓鞘。術后7d和14d，A組（假手術組）病理無明顯改變，其他各組均有不同程度的好轉，隨著胡椒堿給藥劑量的增加，脊髓損傷區(qū)面積逐漸減小而正常組織增多，組織連續(xù)性增加，并可見到膠質細胞增生及疤痕形成，損傷區(qū)囊腔樣變。
　　 2、免疫組化結果
　　 2.1、TNF-α的表達
　　 2.1.1、TNF-α在脊髓損傷中心表達最明顯，A組表達最少，B組表達最多，術后3d、7d、14d，A組陽性細胞數(shù)分級分別為（7.83

15、3±1.169，5.833±0.752，4.833±1.471），染色強度分別是(0，0，0)，IHS分別是(0，0，0)。B組陽性細胞數(shù)分級分別為(86.333±1.211，79.666±1.032，67.666±1.632)，染色強度分別是(3，3，3)，IHS分別是(12，12，9)。小劑量時作用不明顯，C組陽性細胞數(shù)分級分別為（85.166±1.169，78.166±0.752，66.333±1.366），染色強度分別是(3，3

16、，3)，IHS分別是(12，12，9)。相同時間，其余劑量組隨劑量增加，陽性細胞數(shù)減少，染色減低。D組陽性細胞數(shù)分級分別為(82.166±1.169，74.00±0.894，62±1.549)，染色強度分別是(3，2.5，2)，IHS分別是(12，7.5，6);E組陽性細胞數(shù)分級分別為（79.00±0.894，70.33±1.505，58.166±1.169），染色強度分別是(2.5，2.5，2)，IHS分別是(10，7.5，6);F組

17、陽性細胞數(shù)分級分別為(75.00±0.894，65.666±1.632，54.5±1.516)，染色強度分別是(2，2，1)，IHS分別是(6，6，3);G組陽性細胞數(shù)分級分別為(73.833±0.752，64.666±1.940，53.166+1.169)，染色強度分別是(2，2，1)，IHS分別是(6，6，3);H組陽性細胞數(shù)分級分別為(72.666±0.333，62.666±1.751，52.00+1.414)，染色強度分別是(2

18、，1，1)，IHS分別是(6，3，3)。
　　 2.1.2、術后3d、7d、14d，A組分別與各組比較均有顯著性差異(P＜0.05）。術后3d、7d、14d，B組與各劑量組相互比較，發(fā)現(xiàn)早期小劑量給藥時效果不明顯，B組與C組(P=0.813,P=0.224,P=0.889,P＞0.05)比較無明顯差異;B組與D、E、F、G、H組均有明顯差異(P＜0.05)。各劑量組間(C、D、E、F、G、H組)比較，C、D、E、F組比較均有有統(tǒng)

19、計學意義(P＜0.05），F(xiàn)、G、H組比較無統(tǒng)計學意義。術后3d，F(xiàn)組與G組(P=0.388，P＞0.05)，G組與H組(P=0.327，P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.054，P＞0.05)比較均無統(tǒng)計學意義;術后7d，F(xiàn)組與G組(P=0.922,P＞0.05)，G組與H組(P=0.936,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.162,P＞0.05)比較均無統(tǒng)計學意義;術后14d，F(xiàn)組與G組(P=0.807，P＞0.05)，G組與H

20、組(P=0.879,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.192,P＞0.05)比較均無統(tǒng)計學意義。在一定范圍內隨著給藥劑量的增加，差異較明顯，當達到一定劑量后差異無明顯變化，說明存在最適作用劑量。
　　 2.2、IL-6的表達
　　 2.2.1、IL-6表達陽性細胞也主要位于損傷中心區(qū)，在周邊區(qū)逐漸減少。術后3d、7d、14d，A組未見或很少見陽性細胞，隨時間無明顯變化，陽性細胞數(shù)分級分別是(4.83±1.16，4.50

21、±0.54，3.33±0.81)，細胞顯色強度分別是(0，0，0)，IHS分別為(0，0，0);B組表達最多，且染色強度最大，術后3d，小劑量組陽性細胞數(shù)最多，但是差異不明顯，隨胡椒堿劑量的增加陽性細胞數(shù)逐漸減少，細胞顯色強度有所減低，B、C、D、E、F、G、H組陽性細胞數(shù)分級分別為(85.166±3.656，83.833±0.752，77.166±1.471，73.333±1.032，68.00±1.788，66.666±1.632，

22、64.833+1.169)，細胞顯色強度分別是(3，3，3，2.5，2.5，2，2)，IHS分別為(12，12，12，10，6，6，6)。術后7d各劑量組陽性細胞減少，隨著劑量增加陽性細胞數(shù)逐漸減少，細胞顯色強度逐漸減低，差異比較明顯，B、C、D、E、F、G、H組陽性細胞數(shù)分級分別為(81.833±1.471，80.333±1.505，73.166±2.228，67.166±1.940，60.666±1.211，59.000±1.141

23、，57.833±0.983)，細胞顯色強度分別是(3，3，2.5，2.5，2，2，1)，IHS分別為(12，12，12，7.57.5，6，6)。術后14d，陽性細胞數(shù)明顯減少，基本穩(wěn)定，仍高于A組，B、C、D、E、F、G、H組陽性細胞數(shù)分級分別為(74.50±0.836，73.833±0.752，69.833±1.602，63.666±1.211，57.00±3.033，55.333±1.366，53.5±1.378)，細胞顯色強度分別

24、是(3，3，2，2，1，1，1)，IHS分別為(9，9，6，6，3，3，3)。
　　 2.2.2、術后3d、7d、14d，A組分別與各組比較均有顯著性差異(P＜0.05）。術后3d、7d、14d，B組與各劑量組相互比較，早期小劑量給藥時效果不明顯，B組與C組(P=0.998,P=0.787,P=0.921，P＞0.05)比較無明顯差異;B組與C、D、E、F、G、H組均有明顯差異(P＜0.05)。各劑量組間(C、D、E、F、G、H

25、組)比較，C、D、E、F組比較均有有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），F(xiàn)、G、H組比較無統(tǒng)計學意義。術后3d，F(xiàn)組與G組(P=0.952，P＞0.05)，G組與H組(P=0.501,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.083，P＞0.05)比較無統(tǒng)計學意義;術后7d，F(xiàn)組與G組(P=0.522,P＞0.05)，G組與H組(P=0.829,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.052,P＞0.05)比較無統(tǒng)計學意義;術后14d，F(xiàn)組與G組(P=0