DNA連接酶與DNA聚合酶耦聯(lián)核酸識(shí)別體系的建立以及在HIV基因檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的:建立 DNA連接酶與 DNA聚合酶耦聯(lián)的核酸識(shí)別體系以及該體系在HIV基因檢測(cè)中的應(yīng)用初探。
　　方法:選取HIV-1 pol基因保守區(qū)長(zhǎng)度為190bp的一段序列作為檢測(cè)的靶序列。設(shè)計(jì)三條長(zhǎng)DNA序列A、B、C,A、B、C互為模板進(jìn)行擴(kuò)增,從而合成所需 HIV模板。分別設(shè)計(jì)上下游內(nèi)側(cè)半引物與外側(cè)半引物,運(yùn)用連接酶與聚合酶耦聯(lián)核酸識(shí)別體系檢測(cè)有無(wú) HIV模板。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了半引物長(zhǎng)度的探索性研究,然后研究了連接酶緩沖液濃度對(duì)

2、DNA聚合酶工作效率的影響,并選取最適濃度,從而優(yōu)化該核酸識(shí)別體系。利用連接酶對(duì)半引物進(jìn)行連接反應(yīng),然后將連接產(chǎn)物加入到TaqDNA聚合酶介導(dǎo)的PCR體系中,與未加該產(chǎn)物而只加入內(nèi)側(cè)半引物、只加入外側(cè)半引物、以及內(nèi)外側(cè)半引物均加入而不加連接酶的反應(yīng)體系進(jìn)行比較,分析連接酶對(duì)半引物的連接作用有無(wú),以及連接后是否擴(kuò)增。比較研究PfuDNA聚合酶介導(dǎo)的PCR體系中,內(nèi)外側(cè)引物的連接缺口處,配對(duì)與不配對(duì)情況下耦連識(shí)別體系的工作效率。本實(shí)驗(yàn)還將正

3、常人基因組DNA加入反應(yīng)體系中,以檢測(cè)引物特異性,以EGFR基因作為陽(yáng)性對(duì)照,觀察該耦聯(lián)體系的檢測(cè)作用研究該耦聯(lián)核酸識(shí)別體系的工作效率和靈敏度。
　　結(jié)果:用三條人工合成長(zhǎng)DNA序列A、B、C互為模板互為引物的方法,在55℃的退火溫度下方便快捷的合成了檢測(cè)模板。分別利用三對(duì)外側(cè)引物對(duì)(HF-1,HR-1;HF-2,HR-2;HF-3,HR-3)以及三對(duì)內(nèi)側(cè)引物對(duì)(HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2;HFP-3,HRP-

4、3)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),較長(zhǎng)的HF-1,HR-1;HFP-1,HRP-1;HFP-2,HRP-2均可單獨(dú)生成產(chǎn)物,較短的內(nèi)側(cè)半引物對(duì)HFP-3,HRP-3與外側(cè)半引物對(duì)HF-2,HR-2;HF-3,HR-3不能單獨(dú)生成產(chǎn)物。在25μl PCR反應(yīng)體系中,加入0-1μl的10×連接酶緩沖液,得到DNA連接酶緩沖液與DNA聚合酶緩沖液不同濃度比例的反應(yīng)體系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,未加連接酶緩沖液的體系反應(yīng)良好,含0.1μl至0.25μl連接酶緩沖液的體系

5、擴(kuò)增反應(yīng)依次減弱,當(dāng)加入0.5μl或更多時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)被完全抑制,沒(méi)有產(chǎn)物。而PfuDNA聚合酶介導(dǎo)引物延伸反應(yīng)中加入0.1μl的體系反應(yīng)減弱,當(dāng)加入0.25μl時(shí)反應(yīng)幾乎完全被抑制,加入0.5μl或更多時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)被完全抑制,沒(méi)有產(chǎn)物。運(yùn)用上述優(yōu)化的引物HF-3,HR-3;HFP-3,HRP-3以及優(yōu)化的緩沖液比例,在53℃、57℃、61℃、64℃四個(gè)溫度梯度下進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果在57℃及其更高退火溫度下,只加入內(nèi)側(cè)半引物、只加入外側(cè)半引物

6、、以及內(nèi)外側(cè)半引物均加入的體系中均沒(méi)有出現(xiàn)產(chǎn)物,而加入連接反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)體系均能擴(kuò)增出目的產(chǎn)物。在PfuDNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)體系中,較高和較低兩種退火溫度下,缺口不配對(duì)時(shí)均沒(méi)有產(chǎn)物,而配對(duì)時(shí),均有產(chǎn)物出現(xiàn)。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入正常人基因組 DNA,并以 EGFR基因作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí),加入連接酶的體系中出現(xiàn)目的產(chǎn)物,而未加連接酶的體系中沒(méi)有產(chǎn)物。
　　結(jié)論:
　　(1)連接酶反應(yīng)緩沖液對(duì)聚合酶的效率有一定抑制作用。