nm23-H1在人早孕期母-胎界面的生物學調控作用.pdf

1、滋養(yǎng)細胞具有高增殖和侵襲潛能；但在正常妊娠，滋養(yǎng)細胞不發(fā)生過度增殖和遠處轉移，提示可能受到細胞直接或間接作用的分子調控，使滋養(yǎng)細胞侵襲能力維持在生理性動態(tài)平衡。母—胎界面微環(huán)境細胞與分子間的相互作用可以調節(jié)滋養(yǎng)細胞侵入子宮內(nèi)膜及蛻膜。因此，母一胎界面滋養(yǎng)細胞侵襲能力的調控分子可以影響胚泡的正常植入和生長。 23號非轉移性基因H1型（nm23—H1）是經(jīng)典的腫瘤細胞侵襲抑制基因。在滋養(yǎng)細胞相關疾病中，nm23—H1的表達與預后密切

2、相關，可以作為評價滋養(yǎng)細胞疾病進展的參考指標。根據(jù)相關文獻報道，我們推測nm23—H1可能對滋養(yǎng)細胞的生理性侵襲發(fā)揮重要的調節(jié)作用，因此探尋nm23—H1表達調控將有助于闡明生理狀態(tài)下胚泡植入和病理性滋養(yǎng)細胞疾病的分子機制。 本研究在前期研究工作基礎上，進一步關注nm23—H1在人早孕期滋養(yǎng)細胞表達的調節(jié)機制，擬闡明nm23—H1在母—胎界面促進滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質細胞間交叉對話，及對滋養(yǎng)細胞侵襲行為的控制機制。 1、nm

3、23—H1在人早孕期母—胎界面的表達 目的：比較nm23—H1在正常和自然流產(chǎn)患者母—胎界面的表達。 方法：收集早孕期正?；虿幻髟蜃匀涣鳟a(chǎn)的絨毛與蛻膜組織，采用RT—PCR、免疫組織化學、傳統(tǒng)免疫印跡法，分析母—胎界面nm23—H1表達特征，以比較nm23—H1在正常早孕與自然流產(chǎn)組之間的表達差異。 結果：原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞中低度表達nm23—H1；蛻膜基質細胞中高度表達nm23—H1。從mRNA和蛋白水平分析

4、絨毛與蛻膜組織的nm23—H1表達水平發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜nm23—H1表達水平明顯高于正常早孕期（P<0．05）。 結論：人早孕期母—胎界面過表達nm23—H1將導致妊娠失敗。 2、人母—胎界面nm23—H1的表達調控 目的：nm23—H1人在母—胎界面的表達調控。 方法：收集早孕期正常絨毛與蛻膜組織，對原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞進行多種干預，包括妊娠相關激素、炎性介質及CsA處理，用In cell w

5、estern檢測滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質細胞nm23—H1的表達。 結果：本研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用孕酮對滋養(yǎng)細胞無明顯調節(jié)作用；而17β—E2或生理濃度范圍β—hCG均可明顯下調滋養(yǎng)細胞nm23—H1表達； LPS不能引起滋養(yǎng)細胞nm23—H1的表達下調；CsA可降調節(jié)滋養(yǎng)細胞nm23—H1的蛋白表達。 單獨使用孕酮、17β—E2或生理濃度范圍β—hCG，對蛻膜基質細胞nm23—H1的表達無明顯影響；而給予高濃度β—hCG處理時，

6、nm23—H1表達較未處理組顯著下降；低劑量的LPS可以顯著下調蛻膜基質細胞nm23—H1的表達，但此作用并非由炎性介質IL-1β介導；CsA對蛻膜基質細胞nm23—H1無明顯調控作用。 結論：17β—E2、β—hCG下調滋養(yǎng)細胞nm23—H1蛋白水平，提示nm23—H1與正常妊娠有關。CsA也可以下調滋養(yǎng)細胞nm23—H1，提示CsA治療反復自然流產(chǎn)的新療效機制。高濃度β—hCG可降調節(jié)蛻膜基質細胞nm23—H1的表達，提示在

7、滋養(yǎng)細胞疾病狀態(tài)下滋養(yǎng)細胞通過分泌高水平β—hCG抑制蛻膜基質細胞nm23—H1的表達，可能發(fā)生遠處轉移與侵襲。 3、nm23—H1參與調控人早孕期滋養(yǎng)細胞的侵襲能力 目的：nm23—H1在人早孕母—胎界面的調節(jié)作用。 方法：采用胰酶消化、密度梯度離心法成功分離、培養(yǎng)人早孕期滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質細胞，建立直接或間接細胞共培養(yǎng)；使用siRNA干擾技術，成功干擾滋養(yǎng)細胞或蛻膜基質細胞nm23—H1的表達，用Transw

8、ell法分析干擾nm23—H1后，滋養(yǎng)細胞與蛻膜基質細胞細胞共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細胞的侵襲力；用In cell western法分析侵襲相關分子的蛋白表達。 結果：干擾滋養(yǎng)細胞nm23—H1后，滋養(yǎng)細胞的侵襲力明顯增強，與侵襲相關的titin表達水平明顯上調；而MMP和TIMP表達則無明顯改變。干擾蛻膜基質細胞nm23—H1后，蛻膜基質細胞titin及TIMP表達上調；而MMP活性無顯著差異。將干擾nm23—H1的蛻膜基質細胞與滋養(yǎng)

9、細胞共培養(yǎng)，滋養(yǎng)細胞的侵襲力亦明顯增強（P<0．05）。 結論：滋養(yǎng)細胞表達的nm23—H1可通過抑制titin表達而控制人早孕期滋養(yǎng)細胞的侵襲力。蛻膜基質細胞表達較高水平的nm23—H1，可限制滋養(yǎng)細胞的過度侵襲。 4、nm23—H1通過MAPK/ERK1/2信號通路調節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲能力 目的：nm23—H1在人母—胎界面調控滋養(yǎng)細胞侵襲的信號通路。 方法：應用siRNA干擾nm23—H1，然后

10、分析干擾后與侵襲相關的關鍵信號通路激活狀態(tài)。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，MAPK/ERK1/2通路可能是其主要通路。為了驗證nm23—H1調控滋養(yǎng)細胞侵襲能力是否涉及MAPK/ERK1/2信號通路，將干擾nm23—H1的滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質細胞，分別加入信號通路阻斷劑U0126，進行以下分組：si—negative、si—nm23—H1、si—negative+U0126和si—nm23—H1+U0126，用Transwell法研究滋養(yǎng)細胞的侵襲力，以

11、解析MAPK/ERK1/2信號通路介導nm23—H1控制人早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲的可能機制；繼而用In cell western法分析各組與侵襲相關功能分子的蛋白表達水平。 結果：經(jīng)干擾nm23—H1后，滋養(yǎng)細胞系和蛻膜基質細胞內(nèi)P/T—Erk水平明顯升高，并可被U0126完全抑制。通過DSC與滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)（VCT/DSC）發(fā)現(xiàn)，無論干擾滋養(yǎng)細胞系，還是干擾蛻膜基質細胞nm23—H1，滋養(yǎng)細胞侵襲能力均明顯升高；而U0126僅能部

12、分阻斷增高的侵襲性。提示nm23—H1通過抑制MAPK/ERK1/2信號通路降調節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細胞侵襲。U0126能有效消除因干擾nm23—H1對titin的升調節(jié)作用。相關性回歸分析結果顯示，titin表達水平與滋養(yǎng)細胞侵襲性呈正相關。因此，nm23—H1可以通過抑制MAKP/RK1/2信號通路，降調節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細胞或者蛻膜基質細胞表達titin，并進一步控制滋養(yǎng)細胞的侵襲性。 結論：nm23—H1通過抑制MAPK/ERK1