子宮內膜異位癥在位內膜上調表達基因篩查及MAT2A基因功能鑒定.pdf

1、目的：
　　 子宮內膜異位癥(內異癥,Endometriosis,EMs)是育齡期婦女的常見病與多發(fā)病,具有浸潤、轉移及侵襲等惡性腫瘤的特征。迄今為止其發(fā)病機制仍未闡明。關于其發(fā)病機制,經(jīng)血逆流學說是目前最被廣為接受的理論。但該理論不能解釋經(jīng)血逆流的發(fā)生率有80%-90%,而內異癥的發(fā)生率只有10%-15%。大量研究結果顯示,內異癥患者在位內膜與j下常子宮內膜在增殖、侵襲及凋亡等生物學特性方面存在差異。內異癥在位內膜基因表達的異

2、常改變可能是內異癥在位內膜生物學特性發(fā)生改變的基礎,這些改變可能直接影響子宮內膜異位癥的發(fā)病過程。內異癥在位內膜候選基因的基礎研究,其重要臨床意義不僅在于能進一步闡述內異癥發(fā)生機理,還能為臨床診斷途徑的突破、靶基因干預治療的實現(xiàn)奠定理論基礎。
　　 cDNA代表性差異分析法(cDNArepresentationaldifferenceanalysis,eDNA-RDA)是Hubank等在RDA和mRNA差異顯示兩種方法基礎上創(chuàng)立

3、的一種基因克隆方法,己廣泛應用于差異基因表達譜的篩查和新基因的克隆。本課題組旨在通過cDNA代表性差異分析技術篩查內異癥在位內膜上調表達基因,尋找與內異癥發(fā)生發(fā)展密切相關的候選基因。選取篩查獲得的內異癥在位內膜上調表達基因之一,應用Real-timePCR技術擴大樣本進一步檢測該基因在內異癥在位內膜及對照組子宮內膜中的表達,初步驗證篩查結果可靠性的同時,探討該基因在子宮內膜異位癥發(fā)病機制中的作用。
　　 甲硫氨酸腺苷轉移酶2A(

4、methionineadenosyl-transferase,MAT2A)是前期通過cDNA代表性差異分析技術篩查獲得的克隆重復次數(shù)最高的候選基因。目前,MAT2A基因與內異癥相關研究尚未見報道。MAT是生物體內合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的關鍵酶,而SAM是甲基供體和多胺合成的前體,在所有細胞的體內代謝中發(fā)揮核心作用。哺乳動物組織中,存在兩種不同的基因MAT1A和MAT2A,分別編碼兩個同源

5、性MAT催化亞單位α1(形成二聚體的MATⅢ或四聚體的MATⅠ)和α2(形成MATⅡ)。另外還存在MAT2B,編碼調節(jié)亞單位β,主要功能是抑制MATⅡ的活性。MAT1A僅在成人肝組織中表達,MAT2A在所有非肝組織中均表達。研究表明,MAT2A不僅是有絲分裂原活性細胞因子如肝細胞生長因子、瘦素等誘導細胞增殖的重要靶點,而且能通過誘導FasL表達,最終上調細胞內Caspase-3水平,促進細胞凋亡。MAT2A基因表達上調促進細胞增殖、抑制

6、細胞凋亡,目前報道表明與肝癌、結腸癌、膀胱癌、前列腺癌等許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。內異癥雖為良性疾病,卻具有增殖、侵襲、復發(fā)和轉移等類似惡性腫瘤的生物學特性。那么與細胞增殖、凋亡等生物學特性密切相關的MAT2A基因是否也參與內異癥的發(fā)病機制呢?MAT2A在內異癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著什么角色?本研究在國內外首次探討MAT2A在內異癥發(fā)病機制中的作用。
　　 方法：
　　 一、應用cDNA代表性差異分析技術篩查子宮內膜異

7、位癥在位內膜上調表達基因
　　 (一)提取內異癥在位內膜及對照組子宮內膜組織樣本總RNA,分光光度計檢測總RNA純度及濃度,瓊脂糖電泳驗證RNA完整性。
　　 (二)DNA酶去除總RAN中殘留的基因組DNA,消除基因組的污染。
　　 (三)分離內異癥在位內膜及對照組子宮內膜組織總RAN中的mRNA,去除rRNA的污染,分光光度計檢測mRNA純度及濃度,瓊脂糖電泳驗證mRNA提取質量。
　　 (四)分別以內

8、異癥在位內膜組織mRNA及對照組子宮內膜組織mRNA作為模板合成雙鏈cDNA。
　　 (五)內異癥患者在位內膜作為實驗組(Tester組),無內異癥患者子宮內膜作為對照組(Driver組),逐級提高Driver組比例進行2輪消減雜交,獲得內異癥在位內膜中表達上調的差異基因片段。
　　 (六)克隆差異基因片段、菌粒PCR鑒定、測序并同源性分析。
　　 (七)選取篩查獲得的COX-2基因,Real-timePCR檢測

9、內異癥在位內膜及對照組子宮內膜組織中COX-2mRNA的表達,初步驗證篩查結果的可靠性。同時選取克隆重復次數(shù)最高,目前報道生物學特性與子宮內膜異位癥發(fā)病密切相關的MAT2A基因進行后續(xù)深入研究。
　　 二、MAT2A基因在子宮內膜異位癥發(fā)病機制中的作用研究
　　 (一)RealTimePCR、Westernblot及免疫組化技術分別檢測內異癥在位內膜與對照組子宮內膜組織中MAT2AmRNA及蛋白表達。
　　 (二

10、)原代培養(yǎng)內異癥在位內膜間質細胞(ESC)及對照組子宮內膜間質細胞(NSC),免疫細胞化學染色鑒定細胞。同時構建3個MAT2AshRNA表達載體pGC-MAT2A-s1、pGC-MAT2A-s2和pGC-MAT2A-s3轉染ESC;構建pEGFP-C1-MAT2A重組質粒轉染NSC。
　　 (三)RealTimePCR及Westernblot技術分別檢測ESC中MAT2A基因RNA干擾效果及NSC在轉染pEGFP-C1-MAT2

11、A重組質粒后MAT2A表達水平。
　　 (四)CCK-8細胞增殖實驗檢測MAT2A表達改變前后細胞增殖能力的變化。
　　 (五)Transwell細胞侵襲實驗檢測MAT2A表達改變前后細胞侵襲能力的改變。
　　 (六)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MAT2A表達改變前后細胞內SAM、Caspase-3水平變化。
　　 (七)透射電鏡(TEM)觀察MAT2A表達改變前后細胞超微結構的改變。
　　 結果：

12、>　　 一、cDNA代表性差異分析法篩查獲得內異癥在位內膜上調表達基因10個
　　 隨著消減雜交輪數(shù)的增加,所獲得的差異片段數(shù)目減少,特異性擴增信號不斷增強,第二輪雜交后,1.5%瓊脂糖電泳可見條帶集中分布于100-500bp之間?？寺〔町惼嗡蜏y序,177個EST序列測序成功,GenBank中進行同源性比對,其中有8個(4.52%)EST序列在數(shù)據(jù)庫中未找到匹配基因和蛋白,余169個EST序列比對篩查獲得Ems在位內膜上調表

13、達基因lO個。其中已報道與Ems相關基因4個:COX-2、CFLI、BRAF、NRAS;EMs以外疾病相關基因4個:MAT2A、SEPT9、ATAD3A、CADM2;目前所有疾病中未見報道,功能未知基因2個:NAA15、CCDC21。選取COX-2基因,應用RealTimePCR技術驗證篩查結果表明,EMs在位內膜組COX-2mRNA水平顯著高于對照子宮內膜組,與篩查結果一致。
　　 二、MAT2A基因在子宮內膜異位癥發(fā)病機制中

14、的作用研究
　　 (一)內異癥在位內膜和對照組子宮內膜組織中MAT2A基因表達
　　 1.RealTimePCR結果表明,內異癥在位內膜組MAT2AmRNA相對表達水平為3.20±2.05,顯著高于對照組子宮內膜1.23±0.97。
　　 2.Westernblot結果表明,內異癥在位內膜MAT2A蛋白表達(0.63±0.43)高于對照組子宮內膜(0.20±0.08)。
　　 3.免疫組化結果表明,MAT

15、2A在子宮內膜組織的腺體和間質細胞均表達,內異癥在位內膜MAT2A蛋白表達(MOD:0.26±0.13)高于對照組子宮內膜(MOD:0.19±0.12)。
　　 (二)MAT2A對子宮內膜異位癥在位內膜及對照組子宮內膜間質細胞生物學活性的影響
　　 1.RealTimePCR結果及Westernblot結果表明,ESC組MAT2AmRNA及蛋白表達水平顯著高于NSC組。pRC-MAT2A-s1、pRC-MAT2A-s2和

16、pRC-MAT2A-s3組MAT2AmRNA及蛋白表達水平分別與ESC組比較明顯降低,其中pRT-MAT2A-s3組MAT2AmRNA及蛋白表達水平最低。ESC轉染pRC-V質粒組MAT2AmRNA及蛋白表達水平與ESC組比較差異無統(tǒng)計學意義。NSC轉染pEGFP-C1-MAT2A質粒組MAT2AmRNA及蛋白表達水平顯著高于NSC組。NSC轉染pEGFP-C1-V質粒組MAT2AmRNA及蛋白表達水平與NSC組比較差異無統(tǒng)計學意義。<

17、br>　　 2.CCK-8細胞增殖實驗表明,從轉染pGC-MAT2A-s3表達載體48h開始,ESC增殖率明顯受到抑制,轉染pRC-V對照質粒后ESC增殖率無明顯變化;而NSC在轉染pEGFP-C1-MAT2A質粒48h開始,增殖率顯著上調;轉染pEGFP-C1-V質粒后NSC增殖率無明顯變化。
　　 3.細胞侵襲實驗結果顯示,ESC侵襲力顯著高于NSC:轉染pGC-MAT2A-s3表達載體后ESC侵襲力顯著下降,轉染pRC.

18、V對照質粒的ESC侵襲力無顯著變化;NSC在轉染pEGFP-C1-MAT2A質粒后侵襲力顯著提高,轉染pEGFP-C1-V質粒后NSC侵襲力無明顯變化。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗結果表明,ESC組細胞內SAM水平高于NSC組,Caspase-3水平低于NSC組。ESC沉默MAT2A組(pRC-MAT2A-s3)與ESC組比較,細胞內SAM水平降低,Caspase-3水平升高。ESC轉染空質粒組與ESC組比較細胞內SAM、Cas

19、pase-3水平?jīng)]有改變,P＞0.05。NSC轉染pEGFP-C1-MAT2A質粒組與NSC組比較,細胞內SAM水平升高,Caspase-3水平降低。NSC轉染空質粒組與NSC組比較細胞內SAM、Caspase-3水平?jīng)]有改變。
　　 5.透射電鏡實驗表明,雖然ESC組細胞核型較規(guī)則,ESC轉染空質粒組部分細胞核形狀不規(guī)則,兩組細胞均沒有明顯觀察到染色質凝聚邊集。沉默MAT2A表達后,ESC細胞內明顯可見異染色質凝聚邊集,呈現(xiàn)凋

20、亡特征。NSC及NSC轉染空質粒組細胞核不規(guī)則,可觀察到部分染色質邊集發(fā)生,呈現(xiàn)早中期凋亡特征;上調MAT2A表達后,NSC細胞核型較規(guī)則,異染色質邊集少見,凋亡能力降低。
　　 結論：
　　 1.利用cDNA代表性差異分析技術成功鑒定內異癥在位內膜上調表達基因,這些基因或參與新生血管形成,或與細胞信號轉導有關,或與細胞增殖、凋亡密切相關,或與細胞粘附、侵襲相關,可能通過影響子宮內膜的生物學特性,在子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)

21、展中發(fā)揮著重要的作用。COX-2是篩查獲得的內異癥在位內膜上調表達基因之一,本研究通過RealTimePCR實驗進一步驗證表明,內異癥組在位內膜COX-2mRNA表達顯著高于對照組子宮內膜。COX-2基因異常表達可能在內異癥的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.MAT2A基因是篩查獲得的克隆重復次數(shù)最高的內異癥在位內膜上調表達基因,進一步擴大樣本驗證表明MAT2A在內異癥在位內膜組織中的表達顯著高于對照組內膜組織。體外實驗研