巨噬細胞損傷和淋巴管形成障礙導致的糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合的機制研究.pdf

1、[背景]: 糖尿病足部潰瘍(diabeticfootulcer,DFC)作為糖尿病的慢性并發(fā)癥是導致截肢的主要原因之一。不僅給患者帶來巨大的精神壓力、嚴重地影響生活質(zhì)量，同時也造成了沉重的社會經(jīng)濟負擔。 以往的研究表明： (1)局部組織胰島素水平低下導致的創(chuàng)面組織細胞代謝異常； (2)創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)失調(diào)； (3)晚期糖基化產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)

2、引起的皮膚病理生理學改變；均與糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面難愈合相關(guān)。 基于對以上已有研究的思考，本課題設(shè)計為三部分。 第一部分:糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織巨噬細胞數(shù)量及功能損傷和淋巴管形成障礙的研究 [目的]:觀察糖尿病足部非缺血性潰瘍周邊皮膚組織中巨噬細胞數(shù)量、分泌功能和淋巴管形成的情況，以及激活的巨噬細胞和淋巴管內(nèi)皮的關(guān)系，并與相同潰瘍形成時間的非糖尿病足部潰瘍皮膚、正常皮膚組織比較。 [方法]:

3、 1、以年齡、性別及潰瘍形成時間相匹配的糖尿病足部非缺血性潰瘍患者、非糖尿病足部潰瘍患者以及其潰瘍周邊皮膚作為研究對象，以正常皮膚組織作為對照，分別命名為糖尿病足潰瘍組(diabeticfootgroup，DF)、非糖尿病足潰瘍組(non-diabeticfootgroup，NDF)和正常對照組(normalcontrolgroup，NC)。 2、采用HE常規(guī)染色觀察三組皮膚組織學差異。 3、免疫組織化學方法檢測各組CD

4、68、VEGFR3、LYVE-1、VEGFC蛋白表達。 4、RT-PCR檢測各組CD68mRNA、VEGFR3mRNA、LYVE-1mRNA、VEGFCmRNA表達。 5、激光共聚焦顯微鏡檢測各組CD68表達和LYVE-1表達的關(guān)系。 [結(jié)果]: 1、NDF組、DF組和NC組比較，年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05),NDF組和DF組比較，潰瘍形成時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 2、組織學結(jié)果：D

5、F組皮膚組織及NDF組皮膚組織中均有典型的組織學改變，與正常皮膚清晰的表皮復層結(jié)構(gòu)、豐富且致密的膠原排列形成了鮮明的反差。 3、免疫組化結(jié)果： (1)CD68在NC組表皮組織中表達為陽性，其陽性細胞存在于表皮基底部。 (2)LYVE-1在NC組表皮組織表達陽性，陽性細胞集中在表皮基底部。 (3)VEGFR3在NC組表皮組織表達為陽性，陽性細胞主要集中在表皮組織基底部。 (4)VEGFC在NC組表皮

6、組織表達為陽性，陽性信號集中在表皮組織基底層。 4、RT-PCR結(jié)果：DF組和NC組、NDF組比較，CD68mRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；NDF組和NC組比較，CD68mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。 5、激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：NC組表皮組織基底層可見CD68陽性細胞，在表皮組織、表皮組織與真皮組織交界部位可以見到LYVE-1陽性信號，疊加后未見CD68和LYVE-1信號

7、重疊。 [結(jié)論]: 1、糖尿病足部非缺血性潰瘍和非糖尿病足潰瘍皮膚組織均存在表皮組織增厚，真皮組織變薄、真皮組織膠原減少、排列紊亂等。 2、相同潰瘍形成時間的糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織較非糖尿病足部潰瘍皮膚組織巨噬細胞數(shù)量減少，分泌VEGFC的功能降低，淋巴管內(nèi)皮形成減少。 3、非糖尿病足部潰瘍皮膚組織中激活的巨噬細胞能夠轉(zhuǎn)化為淋巴管內(nèi)皮細胞。 第二部分:糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血白細胞

8、VEGFR3表達及VEGFR3+細胞數(shù)量變化的研究 [目的]:探討糖尿病足部非缺血性潰瘍患者、糖尿病患者外周血白細胞中VEGFR3表達和VEGFR3+細胞(淋巴管內(nèi)皮祖細胞)數(shù)量的改變以及其可能的影響因素。 [方法]: 1、分為糖尿病足部潰瘍組(DF組)、糖尿病1組(DM1組，HbAlC<7％)、糖尿病2組(DM2組，HbAlC37％)和正常對照組(NC組)。 2、采集各組清晨靜脈血5ml，抗凝分離得到白

9、細胞作為研究對象。 3、采用RT-PCR檢測各組白細胞中VEGFR3mRNA的表達，并進行統(tǒng)計學分析。 4、記錄除NC組外的各組臨床資料，主要包括：空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、空腹C肽、餐后2hC肽等，并和VEGFR3mRNA表達進行相關(guān)性分析。 5、采用細胞免疫熒光法檢測各組VEGFR3蛋白表達。 6、調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，采用細胞免疫熒光法檢測各組白細胞中VE

10、GFR3+細胞的數(shù)量，并進行統(tǒng)計學分析。 [結(jié)果]: 1、通過非參數(shù)檢驗分析DF組、DM1組、DM2組和NC組患者VEGFR3mRNA的表達，實驗組和NC組比較VEGFR3mRNA表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 2、外周血白細胞VEGFR3mRNA表達和臨床指標的相關(guān)性分析結(jié)果：VEGFR3mRNA表達的相關(guān)因素分別為空腹血糖(Spearman'sr=-0.518P<0.01)；收縮壓(Spea

11、rman's=-0.551P<0.01)；舒張壓(Spearman's=-0.391P<0.05)；糖化血紅蛋白(Spearman'sr=-0.633P<0.01)；與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無顯著相關(guān)。 3、使用Mias-2000高清晰度計算機病理圖文報告系統(tǒng)檢測熒光強度，以每例標本表達量最強的5個高倍視野(×400)的積分光密度值作為該例測定值。DM2組和DF組和NC組比較，VEGFR3蛋白表達減少，差異有統(tǒng)

12、計學意義(P<0.001)。 4、細胞免疫熒光化學結(jié)果比較顯示：DF組外周血白細胞中VEGFR3+細胞數(shù)量最少，其次為DM2組和DM1組，與NC組比較數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 [結(jié)論]: 1、糖尿病患者較正常人外周血白細胞中VEGFR3表達減少，并且隨著糖化血紅蛋白的升高，減少更為顯著。當合并足部非缺血性潰瘍時，無論患者糖化血紅蛋白的高低，VEGFR3表達顯著減少。 2、糖尿病患者和

13、糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血中VEGFR3mRNA表達減少和空腹血糖、糖化血紅蛋白、收縮壓以及舒張壓呈顯著負相關(guān)。 3、糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血白細胞中VEGFR3+細胞(淋巴管內(nèi)皮祖細胞)數(shù)量減少，其可能為創(chuàng)面淋巴管內(nèi)皮形成減少的原因之一。 第三部分:葡萄糖和/或AGE對U937細胞VEGFC基礎(chǔ)分泌量和吞噬功能影響的研究 [目的]:探討U937細胞在葡萄糖、AGE以及兩者聯(lián)合刺激下VEGFC基礎(chǔ)分

14、泌量、吞噬功能的改變。 [方法]: 1、通過ELISA法檢測不同濃度、不同刺激時間的葡萄糖、AGE條件下U937細胞VEGFC基礎(chǔ)分泌量的改變，確定最適合的葡萄糖、AGE刺激時間和濃度，確定聯(lián)合刺激組的組成。 2、將相同培養(yǎng)環(huán)境中的U937細胞分為正常對照組(normalcontrol，NC)、葡萄糖刺激組(glucosegroup，GG)、AGE刺激組(AGEsgroup，AG)以及聯(lián)合刺激組(glucosea

15、ndAGEsgroup，GAG)。 3、采用臺盼藍染色法檢測各組培養(yǎng)后的細胞存活數(shù)量。 4、采用RT-PCR法檢測各組VEGFCmRNA的表達。 5、采用細胞免疫熒光法研究各組VEGFC蛋白的表達。 6、采用墨汁吞噬實驗檢測各組U937細胞吞噬能力的改變。 [結(jié)果]: 1、經(jīng)過預實驗確定1.5mmol/L葡萄糖刺激24h為葡萄糖刺激組，25ug/mlAGE刺激24h為AGE刺激組，兩者聯(lián)合

16、為聯(lián)合刺激組。 2、臺盼藍染色實驗結(jié)果：各組有活性細胞數(shù)量比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3、RT-PCR法檢測VEGFCmRNA，實驗組和NC組比較VEGFCmRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 4、定性分析VEGFC蛋白表達，未加熒光抗體的陰性對照組為(-)，NC組細胞內(nèi)熒光很明亮，定義為高度陽性(+++)，AG組熒光強度較陰性對照組強，較NC組弱，為(++)，GG組細胞熒光強度

17、較弱，和陰性對照組以及NC組比較，熒光強度為(+)，GAG組呈不均勻的熒光，輪廓不清，熒光強度與陰性對照組基本相同為(-)。 5、墨汁吞噬實驗結(jié)果：實驗組和NC組比較吞噬功能降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 [結(jié)論]: 1、15mmol/L葡萄糖刺激24h、25ug/mlAGE刺激24h以及兩者聯(lián)合刺激對于U937細胞的存活沒有影響。 2、15mmol/L葡萄糖、25ug/mlAGE、以及兩者聯(lián)